張左 程帆

男性尿道兼具排尿和排精功能[1]。由于先天畸形或后天損傷、疾病等原因?qū)е履虻罁p傷或狹窄。目前,處理尿道狹窄的方法包括尿道擴(kuò)張、尿道切開(kāi)術(shù)或者更具侵入性的操作比如吻合尿道成形術(shù)和替代尿道成形術(shù)[2]。對(duì)于廣泛和嚴(yán)重的病人，這些方法常常不能解決問(wèn)題而需要做移植物替代。在移植物短缺的情況下，組織工程技術(shù)可能成為解決這一情況的可行的解決方法。本文將從尿道組織工程的細(xì)胞來(lái)源、材料和方法等進(jìn)行綜述。

一、支架材料

理想的支架材料應(yīng)該提供有利于細(xì)胞增殖、遷移和再組織化的多孔環(huán)境，擁有適當(dāng)?shù)睦鞆?qiáng)度和剛性以防新生組織完全形成之前出現(xiàn)崩塌，且支架經(jīng)過(guò)一段時(shí)間能夠完全分解和再吸收，以及沒(méi)有或有較低的免疫原性、毒性和異物反應(yīng)。此外，支架材料應(yīng)當(dāng)具備適當(dāng)理化性質(zhì)能在常規(guī)滅菌條件下進(jìn)行滅菌使用。尿道重建材料包括天然材料和合成高分子材料兩大類(lèi)。

1.生物支架：天然支架既可以是供體通過(guò)物理或生化方式脫細(xì)胞處理得到的脫細(xì)胞組織，也可以是利用膠原、彈性蛋白等天然材料編織而成的生物工程補(bǔ)片[3]。尿道修復(fù)重建中常用的脫細(xì)胞基質(zhì)有小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)、膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(bladder acellular matrices,BAM)、裸人羊膜支架(denuded human amniotic scaffold,dHAS)和脫細(xì)胞海綿體基質(zhì)(acellular corpus spongiosum matrices,ACSM)等。脫細(xì)胞支架有許多優(yōu)點(diǎn)，如保持原有組織的微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)生化成分(包括膠原、彈力蛋白、層黏連蛋白、一些重要的生長(zhǎng)因子和生物活性物質(zhì))，其缺點(diǎn)在于難以控制結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和理化性質(zhì)，這些特點(diǎn)與植入尿道后發(fā)生纖維化和攣縮相關(guān)[4]。Chun等[5]利用脫細(xì)胞膀胱黏膜下層基質(zhì)(bladder submucosa matrix,BSM)與自體尿道組織聯(lián)合治療兔長(zhǎng)段尿道狹窄，BSM/自體尿道組織移植組具有正常的尿道內(nèi)腔，致密的肌層，完全上皮化和再生尿道內(nèi)血管漸進(jìn)性浸潤(rùn)。BSM移植組則顯示角質(zhì)化上皮，大量膠原化纖維結(jié)締組織，缺乏環(huán)狀平滑肌束。因此，采用脫細(xì)胞BSM支架與自體尿道組織移植相結(jié)合的非橫切腹側(cè)嵌套尿道成形術(shù)是一種可行的尿道重建方法。除了脫細(xì)胞補(bǔ)片外，支架還可以由天然材料制成，因其形狀和構(gòu)成與所選材料的細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi)似。膠原是最常用的材料，其他材料還有絲素蛋白、藻酸鹽等。精確且優(yōu)化設(shè)計(jì)支架的各種性能(包括基質(zhì)的選擇、紋理和孔隙率等)對(duì)于在不減少細(xì)胞種植和存活率的情況下取得滿(mǎn)意的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度顯得至關(guān)重要[6]。

2.合成支架：相較于天然支架，合成支架具有較低的成本，獲取便利，倫理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)更低。合成支架可以根據(jù)孔隙尺寸、構(gòu)成以及是永久性還是可吸收的進(jìn)行區(qū)分。目前制造合成支架有多種方法，包括針織、機(jī)織、電紡織、3D打印、沉淀法和注射成模等[7-8]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β通過(guò)調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，Zhang等[9]利用遞送WNT通路抑制劑ICG-001的膠原/PLCL支架用于尿道成形術(shù)以及抑制細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)體內(nèi)體外表達(dá)可行性研究，發(fā)現(xiàn)該負(fù)載有ICG-001的膠原/PLCL復(fù)合支架能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞減少ECM沉積。

3.3D生物打印技術(shù)：可以精確設(shè)計(jì)復(fù)雜且個(gè)體化的支架[10]。3D生物打印機(jī)可以對(duì)活細(xì)胞、合成聚合物和生物材料進(jìn)行高分辨率定位控制，從而能精確重現(xiàn)特定的組織微結(jié)構(gòu)。生物打印技術(shù)已經(jīng)顯示出在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有產(chǎn)生各種可移植組織(包括皮膚、軟骨和骨骼)潛在用途。Zhang等[11]一支國(guó)際聯(lián)合團(tuán)隊(duì)首次證明3D生物打印技術(shù)應(yīng)用于尿道結(jié)構(gòu)的可行性。

4.細(xì)胞片層工程(cell sheet engineering，CSE)自2004年由Oka等[12]提出以來(lái)已經(jīng)頻繁應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括腎臟病學(xué)和泌尿外科方面。細(xì)胞片層是用溫度敏感培養(yǎng)皿制備的：溫敏聚合物聚異丙基丙烯酰胺(poly N-isopropyl acrylamide，PIPAAm)通過(guò)共價(jià)方式結(jié)合到培養(yǎng)皿上，使得多種細(xì)胞在37 ℃時(shí)黏附和增殖；當(dāng)溫度降到32 ℃時(shí)，不需要水解酶，細(xì)胞即會(huì)自發(fā)分離。國(guó)內(nèi)傅強(qiáng)教授領(lǐng)導(dǎo)的小組應(yīng)用細(xì)胞片層技術(shù)制備組織工程仿生尿道并利用超小型超順磁氧化鐵(ultra small super-paramagnetic iron oxide，USPIO)標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行全層尿道重建。收集少量的口腔和脂肪組織，分離出脂肪干細(xì)胞、口腔黏膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞用于制備細(xì)胞片層，然后逐層將細(xì)胞片層制成三層管狀組織工程尿道并用USPIO進(jìn)行標(biāo)記以供后期使用磁共振成像(MRI)進(jìn)行檢測(cè)。接著將管狀尿道植入皮下3周以促進(jìn)再血管化和增強(qiáng)生物機(jī)械強(qiáng)度。最后進(jìn)行為期3個(gè)月的組織工程仿生尿道替代實(shí)驗(yàn)。組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，取出的仿生尿道仍然具有上皮層、纖維層和肌層的三層結(jié)構(gòu)；免疫熒光分析表明，仿生尿道的血管密度在植入皮下3周后顯著提高，并且3個(gè)月后恢復(fù)到與植入前正常尿道組織相近。這些結(jié)果表明，細(xì)胞片層技術(shù)具有使三層仿生尿道在結(jié)構(gòu)和功能上接近原始尿道組織的潛力。

二、種子細(xì)胞

多種自體細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)和增殖后種植到支架上用于修復(fù)損傷和狹窄尿道，這些細(xì)胞包括尿道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮祖細(xì)胞以及從脂肪或骨髓中提取的干細(xì)胞等。研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種細(xì)胞種植方案以最大程度優(yōu)化細(xì)胞存活，增殖和分化。目前，通過(guò)灌注或旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的方案優(yōu)于靜態(tài)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞種植，因?yàn)樗鼈兛梢愿玫啬M生理環(huán)境以促進(jìn)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均勻分布，并使細(xì)胞承受與生理組織相似的機(jī)械力和應(yīng)力[13]。

1.祖細(xì)胞：細(xì)胞存在于多種組織類(lèi)型中，其主要作用是補(bǔ)充因?yàn)樯砀?、衰老或損傷而丟失的細(xì)胞以恢復(fù)組織穩(wěn)態(tài)。祖細(xì)胞的特征是有限的自我更新能力和單分化潛能，其中常見(jiàn)的有上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[14]。(1)上皮細(xì)胞：上皮細(xì)胞包括自體尿道上皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和口腔角質(zhì)細(xì)胞。一般尿道上皮細(xì)胞是從膀胱黏膜取活檢獲取的，常用于尿道和膀胱重建。也有研究人員從膀胱沖洗和尿液中收集尿道上皮細(xì)胞。從尿液中收集的細(xì)胞特征類(lèi)似于膀胱細(xì)胞并且有望用于尿道組織工程。自體表皮細(xì)胞可從陰莖包皮獲取，除非病人已經(jīng)做了包皮環(huán)切術(shù)或其他手術(shù)。實(shí)驗(yàn)中將這些細(xì)胞接種于脫細(xì)胞膠原基質(zhì)然后植入兔尿道，尿道造影顯示尿道沒(méi)有任何狹窄跡象且組織學(xué)亦提示移行細(xì)胞層。口腔角質(zhì)細(xì)胞如頰黏膜角質(zhì)細(xì)胞和舌黏膜角質(zhì)細(xì)胞也可作為上皮細(xì)胞來(lái)源。頰黏膜具有非角化復(fù)層鱗狀上皮，對(duì)機(jī)械磨損有更大的耐受彈性。活檢取樣雖然也會(huì)造成一定損傷，但和膀胱或尿道黏膜活檢取樣相比損害要小得多。(2)平滑肌細(xì)胞：自體平滑肌細(xì)胞不僅有助于血管生成和上皮組織成熟，而且還具有改善細(xì)胞外基質(zhì)順應(yīng)性和組織彈力的潛力。Feng等[15]利用自體舌角質(zhì)細(xì)胞和海綿體平滑肌細(xì)胞種植于豬脫細(xì)胞海綿體基質(zhì)形成3D新尿道組織修復(fù)尿道缺損。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，種植海綿體平滑肌細(xì)胞可促進(jìn)表皮層生長(zhǎng)，改善血管分布以及促進(jìn)自體平滑肌細(xì)胞滲入生物材料使移植物的生物機(jī)械性能得到提升。

2.干細(xì)胞：干細(xì)胞是有自我更新潛力的一類(lèi)細(xì)胞，他們能分化為成熟的非再生細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞[16]。一般來(lái)說(shuō)，干細(xì)胞比祖細(xì)胞未分化程度低，分化潛力更高，其主要特征是自我更新能力和多分化潛能。干細(xì)胞可以作為尿道組織工程或膀胱組織工程的細(xì)胞成分來(lái)源，尤其是當(dāng)機(jī)體因膀胱疾病或惡性膀胱而無(wú)法獲取祖細(xì)胞時(shí)[17]。盡管有許多研究表明，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)是可以分化為尿道上皮細(xì)胞的，但是出于倫理學(xué)顧慮、潛在惡性和細(xì)胞管理等問(wèn)題的考量，胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用目前仍然受到限制[18]。由于存在這些限制，研究人員試圖利用成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)作為替代尿道重建的細(xì)胞來(lái)源[19]，因?yàn)锳SC具有促血管生成、抗纖維化和免疫抑制等特性以及在適當(dāng)條件下分化為所有細(xì)胞系的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源包括骨髓、脂肪組織、肝臟和血液組織等。骨髓干細(xì)胞在離體條件或在體條件下均可以分化為尿道上皮和膀胱干細(xì)胞。Tian等[20]用共培養(yǎng)和條件培養(yǎng)方案成功將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為尿道上皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞。該研究小組還證實(shí)了幾種關(guān)鍵生長(zhǎng)因子在共培養(yǎng)中的作用，包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，血小板生長(zhǎng)因子B鏈同源二聚體，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。然而，獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞需通過(guò)有創(chuàng)的骨髓穿刺，這也就限制了其臨床應(yīng)用。相反，脂肪干細(xì)胞可以通過(guò)吸脂術(shù)大量獲取且其分化潛能已經(jīng)得到廣泛研究。人脂肪干細(xì)胞可以通過(guò)添加全反式維甲酸或與尿道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)分化為尿道上皮細(xì)胞[21]。Moreno-Manzano等[22]發(fā)現(xiàn)，在植入新膀胱10天后，含有脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)的基質(zhì)促進(jìn)了成熟p63和細(xì)胞角蛋白7陽(yáng)性的尿道上皮顯著恢復(fù)。在ADSC基質(zhì)中，波形蛋白中胚層標(biāo)志物在黏膜下層有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)在橫向和縱向平滑肌層中，ADSC基質(zhì)中平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)更高。此外，CD31和S100β反應(yīng)性的分布分別決定了ADSC新膀胱血管化和神經(jīng)支配的增加。尿源性干細(xì)胞的特征包括擁有較長(zhǎng)的端粒和較活躍的端粒酶，他們能夠分化成多種細(xì)胞系并在細(xì)胞膜上表達(dá)若干種間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物[23]。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行誘導(dǎo)分化，尿源性干細(xì)胞可以分化為多種膀胱相關(guān)細(xì)胞，包括功能性尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[24]。

三、生長(zhǎng)因子

多種生長(zhǎng)因子對(duì)于組織再生起著重要作用。天然支架如SIS和BAM保留著原有的細(xì)胞外基質(zhì)，即使經(jīng)過(guò)處理也仍然能夠維持其特有分子構(gòu)成并能表達(dá)相應(yīng)的生長(zhǎng)因子，包括TGF-β和VEGF[25-26]。Jia等[27]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF修飾的膠原支架對(duì)比格犬模型中5cm長(zhǎng)尿道缺損的矯正效果。術(shù)后6個(gè)月，VEGF結(jié)合的新尿道相比對(duì)照組(沒(méi)有結(jié)合VEGF的膠原支架)管腔明顯增大，纖維化程度降低且血管化程度增強(qiáng)。除了生長(zhǎng)因子外，小分子也常作為添加成分以達(dá)到增加支架移植成功率的作用。如，通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β通路抑制過(guò)度纖維化[9]。張楷樂(lè)等評(píng)估了兔尿道狹窄模型中小分子ICG-001對(duì)WNT通路的潛在抑制作用。通過(guò)核殼共軸靜電紡絲技術(shù)，他們制備了一種Ⅰ型膠原-聚混合尿道支架，且負(fù)載有ICG-001分子。在藥物遞送支架釋放的培養(yǎng)基處理后，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和成纖維細(xì)胞的纖連蛋白的表達(dá)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平受到顯著抑制。

四、結(jié)語(yǔ)

基于細(xì)胞和可吸收支架的尿道組織工程在未來(lái)較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)將占有重要地位，異體細(xì)胞或許也能成為潛在細(xì)胞來(lái)源。生物活性細(xì)胞因子在組織工程中的作用有限，因?yàn)橐浦布?xì)胞可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。組織工程尿道成形術(shù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種比較切實(shí)可行的方法，它可以用真正的組織替代技術(shù)來(lái)取代傳統(tǒng)的手術(shù)組織轉(zhuǎn)移技術(shù)。大規(guī)模臨床研究將有助于提高尿道重建組織工程的安全性和可靠性。