趙衛(wèi)華 朱光輝

美國學者Vacanti和Langer于1993年提出組織工程學(tissue engineering)這一概念，給修復重建外科的發(fā)展帶來了新的機遇[1]。之后二十余年，眾多學者探索利用組織工程學方法修復組織缺損、重建結(jié)構(gòu)和功能，效果良好。組織工程學基于對正常組織和病理組織中結(jié)構(gòu)-功能關系的理解，是一門融合工程學和生命科學原理，研發(fā)能夠恢復或改善組織、器官功能的生物替代物的學科[2,3]。

在小兒外科臨床工作中，腫瘤、先天畸形、創(chuàng)傷和感染常導致組織(器官)缺損，需要足夠數(shù)量的組織進行結(jié)構(gòu)和功能的外科重建[4,5]。但和成人相比，兒童自體組織體積小，取組織后供區(qū)殘留畸形，影響美觀。而同種異體器官移植作為一種替代方案，也存在可供移植供體器官短缺的問題[6]。即便確定了合適的供體并進行了移植，供體器官的排斥反應和免疫抑制劑的毒性作用也讓兒童器官移植工作發(fā)展緩慢[7,8]。隨著組織工程的發(fā)展，基于少量自體材料開展的組織工程修復重建能減少損傷，達到長期的功能修復與重建[4,5,9]。因兒童機體可持續(xù)生長的特性，其細胞來源的工程化組織是研究疾病機制和新治療方法的寶貴模型，組織工程與修復重建在小兒外科也得到了長足的發(fā)展。本文介紹組織工程與修復重建在小兒外科的發(fā)展，并討論其所面臨的機遇及挑戰(zhàn)。

一、組織工程與修復重建在小兒外科領域的技術進展

組織工程與重建外科的基本程序是先從機體獲取少量活體組織，用特殊的酶或其他方法將細胞(又稱種子細胞)從組織中分離出來，在體外進行培養(yǎng)擴增，然后將擴增的細胞與具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定比例混合，使細胞黏附在生物材料(支架)上形成細胞-材料復合物，隨后將該復合物植入機體的組織或器官病損部位。隨著生物材料在體內(nèi)逐漸被降解和吸收，植入的細胞在體內(nèi)不斷增殖并分泌細胞外基質(zhì)，最終形成相應的組織或器官，從而達到修復創(chuàng)傷和重建功能的目的[10,11]。它雖然是細胞學、材料學、免疫學、基因工程、仿生學、康復醫(yī)學等多學科交叉融合的產(chǎn)物，但其基礎仍是種子細胞、生物材料和組織構(gòu)建，這三要素的研究發(fā)展是其進步和發(fā)展的基礎。

(一)種子細胞

自體成體細胞來源有限，且生長緩慢，應用潛力小。胚胎和胎兒組織來源的干細胞雖然分化能力強，但存在倫理和成瘤安全性問題。成體干細胞來源廣泛，增殖潛力強，但分裂次數(shù)有限，易累積遺傳變異。誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技術通過導入特定的轉(zhuǎn)錄因子，將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞，不使用胚胎細胞或卵細胞，因此不存在倫理學問題，降低了發(fā)生免疫排斥反應的可能性[12,13]。Hayashi等[14]研究開發(fā)了一種2D培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以通過促進iPSCs的自發(fā)分化，制造出功能性的角膜上皮組織，并通過動物模型驗證。Kannappan等[15]利用iPSCs在體外培養(yǎng)心肌細胞，之后將這些細胞處理制作成“貼片”附于心肌壞死的部位得到有效的修復，基于該方法的實驗和臨床試驗證據(jù)也顯示，心臟左心室的泵送能力得到改善。Ouchi[16]利用源自健康人類供體和肝臟疾病患者的iPSCs，開發(fā)了一種生物工程復合多細胞肝臟的方法，包含肝細胞、星狀細胞和Kupffer樣細胞等，能在實驗室中重現(xiàn)炎癥、纖維化和肝病的特征。目前iPSCs在體外已成功地被分化為神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、心血管細胞和原始生殖細胞等，但其免疫原性、潛在致瘤性與表觀遺傳學變異問題仍是臨床應用的主要隱患[17]。

(二)生物材料

生物材料在推動組織工程領域的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，是生命科學、醫(yī)學、材料科學和工程等學科結(jié)合的產(chǎn)物[18]。生物材料可用來替換、修復和維持器官結(jié)構(gòu)，在過去的二十余年中，許多支架被開發(fā)用于各種組織工程。然而，部分支架的缺點在于機械材料失效、材料相關感染和機體對植入材料的免疫原性反應。考慮到這些局限，為兒童應用而設計的支架需要進一步改進，即材料必須隨著生理和環(huán)境的變化、植入時間的增長而發(fā)生生長和重塑。此外，也要考慮到兒童免疫排斥反應隨年齡增大而出現(xiàn)一些變化的可能。

天然支架由蛋白質(zhì)或碳水化合物組成，具有特殊的生化、機械和結(jié)構(gòu)特性。它們可以從植物或動物組織中提取，具有生物相容性和生物降解性。例如膠原蛋白、殼聚糖、透明質(zhì)酸、纖維蛋白和明膠都是天然的支架材料，已經(jīng)應用于組織的修復和重建[19,20]。豬皮膠原蛋白是一種商業(yè)化移植物，呈片狀，無細胞，不引起免疫反應，可用于腹壁缺損患者。由有機硅衍生物與透明質(zhì)酸片段結(jié)合而成的復合物已經(jīng)被用于治療兒童燒傷患者，能完全覆蓋真皮，促進皮膚愈合。其基質(zhì)的降解速度較慢，為傷口完全愈合提供了足夠的時間[21]。Ruszymah以纖維蛋白為支架培養(yǎng)耳廓軟骨細胞，可用于制備彈性軟骨[22]?；蜓芯勘砻?，組織工程軟骨與天然彈性軟骨相似，可作為兒童耳再造手術的支架。Guyette等[23]使用器官捐贈者的心臟去細胞支架作為材料，接種人的iPSCs及其誘導成的心肌細胞來構(gòu)建組織工程心臟獲得成功，構(gòu)建的“心臟”具有電傳導性、收縮和新陳代謝功能。

人工合成的生物材料由于其物理和生物特性可被改變，且可以大量復制，而成為目前熱門的支架材料。合成生物材料包括乙醇酸衍生物、乳酸衍生物和其他聚酯衍生物、水凝膠等。Shin’oka等[24]采用L-丙交酯/ε-己內(nèi)酯(1∶1)共聚物作為兒童自體骨髓細胞的支架，制作全腔靜脈肺動脈連接的導管和先天性心臟缺陷的補片，患者平均年齡5.5歲，隨訪1.3～31.6個月，導管和補片功能與活體組織相同，CT斷層掃描顯示沒有動脈瘤形成或鈣化。隨著時間的推移，導管直徑增大，而目前的人工假體植入物則沒有這種生長能力。Roh等[25]用聚己內(nèi)酯-丙交酯共聚物包被聚乙醇酸網(wǎng)構(gòu)建可生物降解管狀支架，為兒童心血管組織工程應用創(chuàng)造了一種具有修復、重塑和生長潛能的血管支架。

水凝膠是由在水溶液中膨脹的聚合物鏈組成的，可以是天然的，也可以是合成的，可以在體內(nèi)被天然酶降解并最終被吸收。水凝膠具有典型的生物相容性，含水量大，不引起免疫反應和炎癥。因此，水凝膠可以用來包裹細胞和制作支架[26]。水凝膠也可采用注射的形式用于修復不規(guī)則形狀的缺損，也用于整形手術。這些凝膠在藥物傳遞和細胞包裹方面得到了廣泛研究。有學者以可降解水凝膠和不可降解高密度聚乙烯為內(nèi)固定支架，用人鼻中隔軟骨細胞在無胸腺小鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程氣管，顯示了很好的生物相容性，可見細胞外基質(zhì)形成[27]。硅水凝膠隱形眼鏡在兒童近視方面也得到了廣泛應用。

隨著科技的進步，更多新型的支架材料不斷問世，比如具有導電性能的石墨烯材料支架、具有雙向磁性的納米支架、新型含銅金屬心血管支架材料等。制備支架的方法也在逐漸更新?lián)Q代，如靜電紡絲技術、冷凍干燥法、自組裝法等。研究者仍在進一步增加材料的生物相容性，使其具備一定的穩(wěn)定性和可降解性，將分解產(chǎn)物對機體的毒害作用盡量減少，或開發(fā)無毒產(chǎn)品。此外，還將研究重點放在提高種子細胞在支架材料內(nèi)的生物活性、創(chuàng)造種子細胞成活的微環(huán)境上。

組織工程學最基本也最容易應用于臨床的形式是細胞膜片工程學，首先將細胞加工成膜片狀，然后在此基礎上進行組織的構(gòu)建。細胞一旦成功分散到天然或合成支架上，就可以在體外保存或直接植入宿主體內(nèi)[28]。如果希望擴大細胞群并調(diào)節(jié)支架，則需將支架保持在“生物反應器”中，這是一種維持生理上有利環(huán)境(溫度、大氣、營養(yǎng)介質(zhì)、機械力學等)的裝置，使種植在支架上的細胞增殖和分化達到最佳狀態(tài)。如循環(huán)應力可以改善肌肉組織的力學性能，與行走速度相似的周期性壓縮可增強軟骨的合成，拉伸應力在肌腱和韌帶的損傷工程中非常重要。組織工程心臟需要電起搏刺激細胞收縮，肺組織需要通風系統(tǒng)，使細胞能夠具備交換氧氣的能力[29]。

組織工程室與在體血管預構(gòu)技術相結(jié)合是近年來的新興研究方向。組織工程室采用具有一定硬度的材料，在體內(nèi)隔離出一個相對封閉的空間，再向其內(nèi)放入種子細胞、支架材料或待培養(yǎng)組織，能夠顯著提高移植物存活率[30]。Morrison等[31]報道在患者體內(nèi)利用多孔穹隆狀的組織工程室成功進行脂肪的體積擴增，但大部分組織工程室的研究仍處于動物實驗階段，臨床應用還有很多工作需要完成。

3D打印技術是上世紀80年代出現(xiàn)的一種快速成型技術，由計算機輔助設計數(shù)據(jù)通過成型設備，以材料逐層堆積的方式實現(xiàn)三維實體成型[32]。通過3D生物打印技術制備出來的組織可顯示出良好的再生能力[33]。3D生物打印技術與干細胞的整合在組織工程領域表現(xiàn)出了巨大的潛力，利用3D生物打印技術打印出來的組織工程支架可在時間和空間上做到足夠精確，按需沉積不同種類的細胞、材料、生長因子等，構(gòu)造出來的組織可以與缺損組織的解剖結(jié)構(gòu)相匹配[34]。

Lueders使用水凝膠和臍帶血干細胞打印出心臟瓣膜，生物性能良好[35]。O’Connell等[36]將甲基丙烯酸酯化明膠和甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸作為基底材料， 混合脂肪干細胞，在軟骨損傷部位用生物打印筆進行原位打印，紫外光照射固化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)3D打印成型的干細胞存活率高，軟骨損傷修復快。Di Bella等[37]發(fā)明了一種手持式3D打印設備，用于一期修復綿羊股骨內(nèi)外側(cè)髁負重面全層軟骨缺損，均獲得成功，無并發(fā)癥。Kizawa等[38]應用3D打印技術成功打印具有代謝功能的人類肝臟組織。

迄今為止，隨著生物墨水及相關材料的研發(fā)，3D生物打印機已經(jīng)成功打印出了氣管、食管、皮膚、耳、腎臟、肝臟和血管等人體組織器官，并應用于臨床。但目前仍只能打印靜態(tài)的組織，存在打印后細胞活力無法保證的問題[39]。

二、組織工程與修復重建在小兒外科應用的局限及展望

組織工程學的提出、建立和發(fā)展不但為修復、替代或再生缺損組織提出了更先進的方法，而且可以緩解供區(qū)缺損和不足，同時減少住院的時間和費用。因此，組織工程技術在修復重建外科領域有著廣闊的發(fā)展前景。目前組織工程在兒童骨科、泌尿外科、普外科、神經(jīng)外科、心胸外科等領域已有大量臨床應用實例。骨和軟骨組織工程用于修復骨和軟骨缺損技術已應用于臨床。組織工程尿道用于尿道下裂修復也有臨床報道。組織工程自體角質(zhì)形成細胞薄片用于燒傷后表皮再生的研究已獲成功，并有相應產(chǎn)品問世。組織工程治療先天性心血管畸形、短腸綜合征、氣管置換、神經(jīng)損傷等均有少量病例研究，但還沒有廣泛臨床應用。雖然組織工程與修復重建技術在小兒外科領域取得了長足的發(fā)展，但因為兒童生理及小兒外科疾病病理的特殊性，仍面臨一系列具體的科學和技術層面的挑戰(zhàn)[5,13]。

目前，組織工程和重建外科還不能完全做到解剖重建和功能重建，尚不能提供完整的組織和器官信息，供組織工程和重建外科參考，因此有必要構(gòu)建一套新的基礎科學理論體系，來整合所有關于組織和器官的解剖、生理、生化信息，表達組織或器官應有的時間、空間等生物學特性。目前組織工程移植物和正常組織結(jié)構(gòu)還存在一定差距，不能完全具備正常組織的所有功能。移植物和受體的組織相容性以及移植物血管化、神經(jīng)支配、內(nèi)分泌等問題仍有待解決[13]。所以需要進一步研究基礎干細胞/發(fā)育生物學、材料科學、解剖學和外科技術之間的相互作用，選擇合適的細胞來源，更好地理解和控制生物過程(如干細胞/祖細胞的分離、擴增和分化)，通過3D生物打印等方式生成特定的形狀和三維結(jié)構(gòu)，增強生物反應器系統(tǒng)制造過程的穩(wěn)定性，保證移植物的可生長性，促進功能性植入。

尤其需要指出的是，兒童疾病的生理和病理與成人大不相同。組織工程學中有些為成年人設計的治療方法并不適用于兒童。兒童所需種子細胞、生物因子的量仍處于摸索階段，這些治療方法的療效也并不確切[16]。由于兒童一直處于生長發(fā)育過程之中，組織工程產(chǎn)生的組織需要考慮能否隨患兒生長而生長，而激素的變化可能會對移植物產(chǎn)生影響，因此有必要開展針對兒童先天性缺陷和疾病的動物模型研究，提高對組織工程和重建外科的機制認知，提高療效，減少并發(fā)癥的發(fā)生。

此外，在組織工程和重建外科的應用過程中，越來越多的倫理學問題也逐漸凸顯，例如如何獲得胚胎和胎兒組織來源的干細胞以及安全性問題，植入動物來源的支架材料可能引發(fā)的不良反應，基因工程技術引入組織工程的安全性，組織工程和修復重建在胎兒應用的風險及費效比等，都是需要患者和醫(yī)生密切關注的問題[40]。

近年來，組織工程與修復重建在小兒外科領域已進入快速發(fā)展時期，并將不斷深入。相信在不久的將來，組織工程產(chǎn)品會在小兒外科組織器官的缺損修復重建過程中得到廣泛應用。同時，隨著組織工程醫(yī)療產(chǎn)品標準化、修復重建流程化及醫(yī)學倫理學研究的深入，相關的法律法規(guī)也將陸續(xù)出臺，對其進行規(guī)范，倫理道德方面的問題也將迎刃而解。