謝山周 王佳慧 虞芳梅 黃敏華 黃海冰 韋慧玲 劉海微 趙越超 曹振（通訊作者）

（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院 廣西 桂林 541100）

氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)是指機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化功能失衡，是機(jī)體氧自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素[1]。茶多酚具有強(qiáng)的氧自由基清除能力[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測受氧化應(yīng)激損傷的體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞在茶多酚（Tea PolyPhenols，TPs）干預(yù)下的增殖活性和成骨分化相關(guān)指標(biāo)，來確定可對抗細(xì)胞損傷的茶多酚最佳濃度，并探明其過程和氧化應(yīng)激方面的機(jī)理，為茶多酚在相關(guān)骨病的治療藥物開發(fā)上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 溶液配制

用完全培養(yǎng)基配制不同終濃度的茶多酚母液(10 ～1μg/mL、100μg/mL、101μg/mL)。用磷酸鹽緩沖液(PhosPhate Buffered Saline，PBS)配成終濃度為10 ～5mol/L 的過氧化氫（hydrogen Peroxide，H2O2）。

1.2 藥物處理及成骨細(xì)胞增殖和分化指標(biāo)檢測

H2O2 處理成骨細(xì)胞作為對照組，在H2O2 處理的基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的茶多酚母液作為藥物組，通過MTT 法檢測成骨細(xì)胞增殖，試劑盒檢測成骨細(xì)胞培養(yǎng)液上清堿性磷酸酶（alkaline PhosPhatase，ALP）活性及礦化沉積染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 不同濃度茶多酚對氧化損傷后成骨細(xì)胞增殖的影響

與10 ～5mol/LH2O2對照組相比，10 ～1μg/mL、100μg/mL 茶多酚干預(yù)72h 后，氧化損傷后的成骨細(xì)胞OD 值顯然升高，10 ～1μg/mL TP 組尤為顯著，表示低濃度的TP 氧化損傷后的成骨細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用（P＜0.05）；濃度101μg/m TP 處氧化理組干預(yù)72h 后，死細(xì)胞漂浮多，與對照組相比OD 值顯然降低，說明高濃度TP 對損傷后的成骨細(xì)胞增殖有抑制作用（P＜0.05）(圖A)。

2.2 不同濃度茶多酚對氧化損傷后成骨細(xì)胞培養(yǎng)液上清ALP 活性的影響

與 10 ～ 5mol/L H2O2對照組相比，10 ～ 1μg/mL、100μg/mL、101μg/mL 茶多酚干預(yù)3 天后，各濃度組的ALP活性均沒有顯著差異(P＞0.05)；茶多酚干預(yù)6 天后，10 ～1μg/mL、0.1 μg/mL 濃度組ALP 活性較對照組顯著升高（P＜0.05）（圖B）。說明較低濃度的茶多酚對氧化損傷后成骨細(xì)胞培養(yǎng)液上清ALP 活性有促進(jìn)作用，藥物作用效果表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。

2.3 不同濃度茶多酚對氧化損傷后成骨細(xì)胞礦化沉積染色結(jié)果的影響

與10 ～5mol/L H2O2對照組和其他各組相比，10 ～1μg/mL 茶多酚處理組的鈣結(jié)節(jié)區(qū)域較大（圖C2 紅色箭頭處）。

圖A 不同濃度茶多酚對氧化損傷后成骨細(xì)胞增殖的影響圖B 不同濃度茶多酚對氧化損傷后成骨細(xì)胞培養(yǎng)液上清ALP 活性的影響

圖C 不同濃度茶多酚對氧化損傷成骨細(xì)胞礦化沉積染色結(jié)果的影響xi

3.討論

茶多酚類物質(zhì)的抗氧化生物學(xué)活性，己被廣泛應(yīng)用于臨床的各個(gè)領(lǐng)域，如抗癌、降低血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)生等等[3]。骨質(zhì)疏松病理機(jī)制的一個(gè)重要方面是成骨細(xì)胞的增殖與骨向分化受到抑制，從而使骨小梁變得稀疏、斷裂，骨質(zhì)量和骨量均下降[4]。茶多酚對骨細(xì)胞的影響與茶多酚的抗氧化性密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)以過氧化氫作為氧自由基，構(gòu)建氧化損傷成骨細(xì)胞模型，以不同濃度的茶多酚作為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果表明：低濃度（0.1 μg/mL）茶多酚對氧化損傷成骨細(xì)胞有增殖作用，而高濃度TP有相反作用。低濃度的茶多酚可以使氧化損傷成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性提高，并使得氧化損傷成骨細(xì)胞礦化沉積增多，從而影響成骨細(xì)胞的分化。

綜上所述，0.1 μg/mL 的茶多酚可削弱成骨細(xì)胞活性氧氧化損傷，促進(jìn)成骨分化。