蘇 贊， 陳皓睿， 薛 云， 鄒克興， 孫建生，農(nóng)李政， 李季剛， 龍章德， 申佩弘*

1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005

六堡茶作為一種特色發(fā)酵茶，具有良好的保健功效。有研究表明：六堡茶的醇提物(0.3 g/kg),能夠降低總膽固醇和總甘油三酯含量，具有調(diào)節(jié)高血脂癥和抗凝血作用[1]。還有研究證明六堡茶能夠提高胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝，改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用[2]。有這樣獨(dú)特品質(zhì)的前提是制作過(guò)程中的微生物發(fā)酵活動(dòng)對(duì)其品質(zhì)形成的影響。因?yàn)榱げ柚谱鬟^(guò)程中微生物發(fā)酵作用強(qiáng)烈，所以在其微生物群落中，耐高溫的真菌占有很大的比例。本研究所用到的微生物是從六堡茶中分離篩選到的散囊菌屬真菌，其可在較高溫度下生長(zhǎng)(高于40 ℃)[3]。本研究利用以上真菌菌株，探討其在液態(tài)發(fā)酵方面的特性，以及應(yīng)用價(jià)值。為利用散囊菌屬真菌提升其他茶和煙葉的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：來(lái)自實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)分離鑒定。AspergilluschevalieriE2,AspergilluschevalieriE3,AspergilluscristatusE6。

發(fā)酵用茶葉：產(chǎn)自廣西三江縣某茶園，品種是“白毫毛尖”，按一芽一葉采摘。殺青烘干后，裝于自封袋中19 ℃儲(chǔ)存。

茶粉：使用粉碎機(jī)粉碎發(fā)酵用茶葉至細(xì)小碎塊。

液體茶粉培養(yǎng)基：取粉碎的茶粉2.5 g，蔗糖1 g加入容積為150 mL的三角瓶中，加入蒸餾水50 mL，115℃滅菌15 min。

優(yōu)化察氏培養(yǎng)基[4]：NaCl 32 g，蔗糖20 g，NH4NO33 g，MgSO40.5 g，K2HPO4·3H2O 1 g。體系為1 L，pH為自然，固體培養(yǎng)基添加1.5%(w/v)的瓊脂，滅菌方式為115℃ 15 min。

酒石酸鐵溶液：稱取七水硫酸亞鐵1 g，酒石酸鉀鈉5 g，蒸餾水定容至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀(美國(guó)博騰BioTek)；恒溫?fù)u床(美國(guó)New Brunswick Scientific)；恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；渦旋振蕩器(美國(guó)賽洛捷克SCILOGEX)；超凈工作臺(tái)(AIR TECH)；真空抽濾機(jī)(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；真空濃縮機(jī)(德國(guó)艾本德Eppendorf)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1在茶粉培養(yǎng)基中的發(fā)酵與其化學(xué)成分分析

孢子懸液的制作參考龍章德的方法[5]。在無(wú)菌環(huán)境下分別將三株真菌的孢子懸液50 μL接種至液體茶粉培養(yǎng)基，31℃靜置培養(yǎng)，每天分別各取出3瓶觀察生長(zhǎng)情況。第2 d、4 d、6 d的發(fā)酵液從培養(yǎng)箱中取出后，分別吸出2 mL發(fā)酵液置于15 mL的離心管，加入4 mL石油醚(沸程60 ℃～90 ℃)，于渦旋振蕩器上混勻5 min，6 000 r/m離心10 min，取上層石油醚萃取液于新離心管中，于真空濃縮機(jī)中使石油醚揮發(fā)，得到提取物粉末。用50 μL石油醚重新溶解提取物，各取10 μL按順序在硅膠板上劃線，寬度為1 cm，線距離硅膠板下沿大約1.5 cm。待硅膠板上點(diǎn)樣處的石油醚溶劑揮發(fā)干后，將硅膠板浸入約1 cm深的石油醚∶丙酮 = 10∶1(v/v)展開劑中，展層時(shí)間約為15 min，完成后取出于通風(fēng)櫥中風(fēng)干，于254 nm紫外下觀察。

1.3.2發(fā)酵茶粉培養(yǎng)基酶活力分析

發(fā)酵后茶粉培養(yǎng)基中的果膠酶、纖維素酶、淀粉酶三種生物質(zhì)水解酶的活力的測(cè)定方法參考龍章德的研究[5]。

1.3.3液體茶粉培養(yǎng)基發(fā)酵前后的成分分析

發(fā)酵后茶粉培養(yǎng)基中還原糖與總糖含量、氨基酸含量、總抗氧化能力、DPPH·降解能力等是反映茶湯質(zhì)量的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)方法參考龍章德的研究[5]。此外，還測(cè)定其茶多酚含量，采用酒石酸鐵比色法[6]，具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)采用陳皓睿的實(shí)驗(yàn)操作流程[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 在茶粉培養(yǎng)基中的發(fā)酵與其化學(xué)成分分析

從圖1可以看出三株真菌在液體茶粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。E2在5 d形成可見(jiàn)菌絲球，并隨時(shí)間推移增大；E3在茶粉培養(yǎng)基上1 d即可在液體與瓶壁接觸的地方形成金色帶狀氣生結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間推移擴(kuò)大，5 d液體中形成明顯的菌絲球；E6生長(zhǎng)情況與E2相似。與在茶葉發(fā)酵部分不同，本實(shí)驗(yàn)液體茶粉培養(yǎng)基中E3沒(méi)有展現(xiàn)出明顯的無(wú)性型世代(無(wú)性型為大量灰綠色分生孢子梗結(jié)構(gòu))，龍章德的研究[5]展示了這三株真菌在液體煙梗粉培養(yǎng)基中都以有性型世代為偏好，并且產(chǎn)生更多的氣生結(jié)構(gòu)。因此不同的環(huán)境能調(diào)控它們的繁殖偏好。譚玉梅的研究尋找到了一些與有性型調(diào)控相關(guān)的基因[7]。關(guān)于曲霉屬真菌世代調(diào)控的研究有助于其在茶葉發(fā)酵中的應(yīng)用，原因是散囊菌屬真菌的無(wú)性型導(dǎo)致茶葉有“霉變”的表觀質(zhì)量，本研究中只有E6符合茶葉發(fā)酵的要求，而如果能調(diào)控有更好的發(fā)酵性質(zhì)的此屬真菌的世代，使其向有性型靠攏，便能在不影響表觀質(zhì)量的基礎(chǔ)上提高發(fā)酵成茶品質(zhì)。

從圖2可知三株菌的2 d液體培養(yǎng)物中產(chǎn)生了三種在紫外光下都呈粉色的色素，并且條帶的位置高度相似；此外靠近展層前沿的位置有藍(lán)色條帶，在未發(fā)酵對(duì)照和E3的液態(tài)發(fā)酵液中存在，并且E3發(fā)酵液中此物質(zhì)濃度比未發(fā)酵對(duì)照高；而E2和E6的液態(tài)發(fā)酵液中此物質(zhì)含量急劇減少。此屬真菌在發(fā)酵時(shí)向培養(yǎng)基中分泌色素物質(zhì)，有研究表明冠突散囊菌分泌的色素類物質(zhì)大致有蒽醌類衍生物、蒽醌雜環(huán)類物質(zhì)、酰胺類物質(zhì)以及酚醛類物質(zhì)[8]，這些生物活性物質(zhì)都有抗氧化活性。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)茶湯抗氧化活性的對(duì)比，能為之后抗氧化活性物質(zhì)的篩選提供幫助。

圖1 各菌株在液體茶粉培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

注：每一張層析圖從左至右依次為未發(fā)酵對(duì)照，2 d、4 d、6 d液體培養(yǎng)物抽提物

2.2 茶粉培養(yǎng)基發(fā)酵液中酶活力分析

從圖3～5可以看出三株真菌在液體茶粉培養(yǎng)基內(nèi)的水解酶活力都較低。果膠酶活力：E2從第6 d開始上升，E3從第5 d開始上升，E6則從第3 d開始；所定時(shí)間范圍內(nèi)，最高酶活都在第8 d，分別為2.52 U/mL、3.44 U/mL和5.15 U/mL。纖維素酶活力：E2平穩(wěn)上升，E3在4 d ～7 d期間迅速上升，E6在3 d～5 d期間迅速上升，但在5 d～7 d期間不再上升；所定時(shí)間范圍內(nèi)最高酶活都在第8 d，分別為0.57 U/mL、0.82 U/mL和1.10 U/mL。淀粉酶活力：三株菌分別在第5 d ～6 d、4 d ～6 d和2 d ～6 d有上升的趨勢(shì)，最高酶活分別在第8 d(0.31 U/mL)、第6 d(0.35 U/mL)和第8 d(0.49 U/mL)。與龍章德在應(yīng)用這三株真菌在液體煙梗粉培養(yǎng)基中的情況相比[5]，本實(shí)驗(yàn)液體茶粉培養(yǎng)基內(nèi)的水解酶活力上升速度相對(duì)更緩慢，但水解酶分泌能力最強(qiáng)的依然是E6，其次為E3，最弱的是E2。

2.3 液體茶粉培養(yǎng)基發(fā)酵前后的成分分析

根據(jù)圖6，三株真菌的發(fā)酵都能大幅提高液態(tài)發(fā)酵液中的還原糖含量，增幅分別達(dá)到131.70%、627.02%和459.12%；總糖含量同樣呈上升趨勢(shì)，增幅分別達(dá)到6.84%、35.25%和2.07%。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明它們?cè)谒o培養(yǎng)條件下能自身合成糖類物質(zhì)。與龍章德的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]不同的是：本實(shí)驗(yàn)三株真菌在液體茶粉培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵總糖含量顯著增加，說(shuō)明不同的培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)它們利用糖的行為有完全不同的影響。

圖3 各菌株液體茶粉培養(yǎng)基發(fā)酵液的果膠酶活力

圖4 各菌株液體茶粉培養(yǎng)基發(fā)酵液的纖維素酶活力

圖5 各菌株液體茶粉培養(yǎng)基發(fā)酵液的淀粉酶活力

注：與各自對(duì)照組比較，P<0.05用*表示，P<0.01用**表示

圖7展示了發(fā)酵后液體培養(yǎng)物的氨基酸含量，E2與E3分別下降了17.43%與32.68%，E6上升了0.52%。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的是，楊金梅使用不同的金花菌發(fā)酵鐵觀音茶湯，結(jié)果顯示大部分樣品的發(fā)酵前后茶湯氨基酸含量變化不顯著[10]。原因可能是本實(shí)驗(yàn)不是采用浸提液，而是直接將攪碎的茶粉直接制成液體培養(yǎng)基，這樣，在微生物的作用下茶中的成分不斷釋放到液體中。龍章德[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)相同，在液體煙梗粉培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵其氨基酸含量減少。

注：與各自對(duì)照組比較，P<0.05用*表示，P<0.01用**表示

用于測(cè)定三株菌總抗氧化活性和DPPH·自由基清除能力的液態(tài)發(fā)酵液均稀釋1 000倍。圖8與圖9顯示這兩種活性都得到了顯著提升。E3的總抗氧化活性提升最大，提升了65.87%；E2的DPPH·自由基清除能力提升最大，提升了128.33%。這樣的結(jié)果與龍章德對(duì)于其在煙粉培養(yǎng)基中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]相反，說(shuō)明三株菌的液態(tài)發(fā)酵更能保存或釋放茶葉的抗氧化活性，或者是比在固態(tài)發(fā)酵的狀態(tài)下產(chǎn)生了更多的此類活性物質(zhì)。李瑩對(duì)冠突曲霉的色素提取物進(jìn)行了分離，發(fā)現(xiàn)有部分組分具有清除DPPH·和ABTS+自由基的能力，但都比維生素C弱[10]。

注：與各自對(duì)照組比較，P<0.05用*表示，P<0.01用**表示

注：與各自對(duì)照組比較，P<0.05用*表示，P<0.01用**表示

由圖10可知三株菌液態(tài)發(fā)酵物的茶多酚含量都顯著增加，增幅分別達(dá)到50.85%、51.58%和53.06%，增長(zhǎng)水平一致。此結(jié)果與楊金梅的研究結(jié)果相反，后者的茶湯浸提物發(fā)酵液茶多酚含量在發(fā)酵24 h就急劇下降[9]，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件更有利于發(fā)揮散囊菌屬真菌在液態(tài)發(fā)酵方面的優(yōu)勢(shì)。

注：與各自對(duì)照組比較，P<0.05用*表示，P<0.01用**表示

3 結(jié)論

本研究中三株真菌在液體茶粉培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果顯示三株真菌的生長(zhǎng)良好，并分泌數(shù)種在紫外光下呈粉色的色素類物質(zhì)，是潛在的生物活性物質(zhì)，有待后續(xù)分析。對(duì)液體茶粉發(fā)酵液的糖類水解酶活力的分析顯示三株真菌都能分泌一定量的果膠酶、纖維素酶與淀粉酶，但酶活力都非常低。水解酶分泌能力最強(qiáng)的是E6，其次為E3，最弱的是E2。三株真菌的發(fā)酵能顯著改變培養(yǎng)基中部分成分的含量，總體來(lái)說(shuō)，還原糖和總糖含量大幅增加，氨基酸含量下降或略微上升，總抗氧化能力和DPPH·自由基清除能力提升，茶多酚含量顯著提升。這些優(yōu)良特性可以用于改善茶葉制品或煙草制品的品質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)行更廣泛深入的研究。