蔣凱麗， 周新麗*， 高海燕

1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093;2.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444

櫻桃番茄又被稱為圣女果、小西紅柿，為多汁漿果，具有果皮薄、怕擠壓、呼吸作用強(qiáng)和富含糖分等特點(diǎn)，極易受真菌感染，耐貯性差，因此櫻桃番茄的采后保鮮一直是影響果農(nóng)收入的主要問題。櫻桃番茄果實(shí)的采后病害[1,2]主要有灰霉病、炭疽病、根霉果腐病等，對(duì)于櫻桃番茄病害的防治，目前仍已化學(xué)殺菌劑為主，然而長期使用化學(xué)試劑不僅會(huì)誘導(dǎo)果蔬的耐受性，還會(huì)對(duì)食品安全和生態(tài)環(huán)境造成一系列負(fù)面影響。

研究發(fā)現(xiàn)[3]自然界中存在一些微生物，能夠有效抑制果實(shí)表面菌絲生長，防止由于病原菌侵染導(dǎo)致的果蔬采后腐爛，實(shí)現(xiàn)采后保鮮，即生物防控。如一些熒光假單胞菌菌株[4]可以有效控制番茄灰霉病，枯草芽孢桿菌菌株[5-7]能夠有效地控制柑橘的青霉病、櫻桃的褐腐病，解淀粉芽孢桿菌[8-10]可以抑制西瓜?；图怄哏牭毒?、石榴枯萎病等，這種方法不僅能防御采后病害，而且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。但是目前生物防控在實(shí)際應(yīng)用中仍存在許多問題，包括在商業(yè)條件下效果的不一致性、對(duì)波動(dòng)的環(huán)境條件的有限耐受性以及耐儲(chǔ)存制劑生產(chǎn)困難，因此國內(nèi)外學(xué)者致力于研究高效、穩(wěn)定和具有廣譜抑菌性的生物防治細(xì)菌。

從果實(shí)、植物根部、土壤等[11,12]分離出的生物防治細(xì)菌比其他來源更安全，本文擬通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，從櫻桃番茄成熟紅果上分離篩選對(duì)其采后病原菌有抑制作用的生物防治細(xì)菌，并對(duì)其形態(tài)特征、生理生化特性、生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步研究開發(fā)高效穩(wěn)定安全的生防治劑、解決果蔬采后腐爛變質(zhì)的病害控制提供理論依據(jù)，為果蔬采后保鮮工作做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

病原真菌：極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)，黑曲霉(Aureobasidiummelanogenum)，青霉菌(Penicilliumoxalicum)，尖側(cè)多隔孢霉(Pleurophragmiumacutum)，擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)，鹽生枝孢霉(Cladosporiumhalotolerans)，子囊菌(Ascomycota)，膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)均由上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品質(zhì)量與安全控制實(shí)驗(yàn)室篩選分離自櫻桃番茄并保存。

試劑：牛肉浸膏、酵母浸膏、氯化鈉、魚粉蛋白胨、葡萄糖和瓊脂均購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，HBI芽孢桿菌生化鑒定條購于青島海博生物技術(shù)有限公司，馬鈴薯購自菜市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

YP5001 電子天平，上海菁海儀器有限公司；立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HH-B11-600-S-II 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DHZ-DA 大容量全溫振蕩器，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PB-10 pH計(jì)，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；C1000Touch PCR儀，上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)基制備

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(LB)：牛肉浸膏5 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉5 g，魚粉蛋白胨10 g，自來水定容至1 000 mL，pH調(diào)整為7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于拮抗細(xì)菌的培養(yǎng)。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再加瓊脂粉18 g。

葡萄糖馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)：200克馬鈴薯去皮切成小塊后置于600 mL蒸餾水中煮沸20 min，8層紗布過濾后取其上清液，加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，等待其溶解后用自來水定容至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.2拮抗細(xì)菌KL-1分離、純化

根據(jù)五點(diǎn)取樣方法，在上海躍科蔬菜原種場(chǎng)取櫻桃番茄成熟紅果，每份樣品分別稱取10 g，加入90 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃下150 r/min轉(zhuǎn)速震蕩48 h，然后用無菌移液器吸取1ml菌液，用滅菌蒸餾水濃度梯度稀釋成10-1至10-7的濃度，將10-5、10-6和10-7濃度的菌液分別取0.1 mL涂布倒于LB培養(yǎng)基平板上。每個(gè)稀釋度重復(fù)三次，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后將每個(gè)平板上的單菌落劃線到其他新鮮平板上以進(jìn)行菌種的純化。

1.3.3拮抗細(xì)菌KL-1的篩選[13-15]

初篩：取極細(xì)鏈格孢菌病原菌菌塊置于PDA平板中央，在距離病原菌菌塊2 cm兩側(cè)點(diǎn)接純化的待篩選細(xì)菌，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察兩個(gè)菌落生長情況，是否有抑菌圈產(chǎn)生，篩選出對(duì)病原菌表現(xiàn)抑制的菌株。

復(fù)篩：取八種病原菌菌塊置于PDA平板中央，用接種環(huán)挑取有抑菌效果的細(xì)菌點(diǎn)接在距平板中央3 cm處的4個(gè)角點(diǎn)上，放入培養(yǎng)箱28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，每組處理做三個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)兩次。以只接種病原菌的PDA平板培養(yǎng)基作對(duì)照，觀察病原菌的生長狀態(tài)，測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算菌株的抑制率。

1.3.4菌株KL-1的鑒定[16,17]

1.3.4.1KL-1形態(tài)特征鑒定

將待測(cè)菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落的顏色、形態(tài)、透明度等特征，并通過使用光學(xué)顯微鏡和革蘭氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4.2KL-1生理生化特性鑒定

V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、D-木糖利用、L-阿拉伯糖利用、D-甘露醇利用、明膠液化試驗(yàn)、7%NaCl生長、pH 5.7生長、硝酸鹽還原、淀粉水解、厭氧性測(cè)定，每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.3.4.3KL-1分子生物學(xué)鑒定

對(duì)KL-1進(jìn)行16S rDNA鑒定，將菌種接種在LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，然后用生工公司的細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取菌株的DNA。PCR擴(kuò)增：使用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′，下游引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系，其中：10×PCR buffer 5 μL；dNTP 4 μL；引物各1 μL；TaqDNA酶0.4 μL；模板2 μL；用ddH2O補(bǔ)足到50 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃保溫10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具對(duì)序列進(jìn)行同源性分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5菌株KL-1的生物學(xué)特性研究[18,19]

1.3.5.1種子培養(yǎng)液的制備

將在LB固體培養(yǎng)基上預(yù)先活化的KL-1接入滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min培養(yǎng) 24 h，用無菌蒸餾水將濃度調(diào)至1×108CFU/L，即為KL-1種子培養(yǎng)液。

1.3.5.2生長曲線的測(cè)定

接種1 mL KL-1種子培養(yǎng)液到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)。取菌體培養(yǎng)液5 mL，每隔3h用分光光度計(jì)在600 nm 波長下測(cè)吸光度，觀察曲線情況，至少測(cè)至48 h。以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，校正零點(diǎn)，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.5.3最適生長pH的測(cè)定

配制LB 液體培養(yǎng)基，用NaOH分別調(diào)成100 mL pH為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，滅菌后分別接種1 mL KL-1種子培養(yǎng)液于100 mL調(diào)至不同pH的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)，48h后用紫外可見分光光度計(jì)在 600 nm 波長下測(cè)其吸光度。以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.5.4最適生長溫度的測(cè)定

接種1 mL KL-1種子培養(yǎng)液于100 mL pH 為 7.0 的 LB 液體培養(yǎng)基中，于 20 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)，48 h后用分光光度計(jì)在600 nm波長下測(cè)其吸光度。以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)均設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表達(dá)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，運(yùn)用Origin 2019b進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株KL-1的篩選

以櫻桃番茄成熟紅果為樣本，櫻桃番茄最常見的病原真菌極細(xì)鏈格孢菌為指示菌，通過平板拮抗試驗(yàn)，從櫻桃番茄成熟紅果上篩選得到一株抑菌效果明顯的拮抗細(xì)菌，將其命名為KL-1。再對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見圖1。從圖中可看出，拮抗細(xì)菌KL-1對(duì)于七種病原菌：極細(xì)鏈格孢菌、黑曲霉、青霉菌、擬康寧木霉、鹽生枝孢霉、子囊菌和膠孢炭疽菌都有明顯的抑制作用，其中KL-1對(duì)黑曲霉的抑制率最大為81%，對(duì)其他六種病原菌抑制率也均高于70%，對(duì)尖側(cè)多隔孢霉的抑制率為0，說明菌株KL-1具有廣譜抑菌性，可以抑制番茄中的多種病原真菌。

圖1 KL-1對(duì)病原菌的抑制率

2.2 菌株KL-1的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

菌株KL-1在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12 h后，菌落形態(tài)呈規(guī)則圓形，邊緣整齊，淡黃色無光澤，不透明(圖2)。光學(xué)顯微鏡(×100油鏡)下觀察，菌體細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏染色呈陽性(圖3)。

2.2.2生理生化鑒定

如表1所示，KL-1菌株V-P試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，不能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，能利用D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇，能液化明膠，在7%NaCI不可以生長，pH 5.7可以生長，硝酸鹽還原呈陽性反應(yīng)，能水解淀粉，無法在厭氧條件下生長。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中有關(guān)芽孢桿菌種屬鑒別特征的描述，初步推測(cè)該菌為芽孢桿菌屬，具體種還需要進(jìn)一步鑒定。

圖2 KL-1在LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)12 h后的菌落形態(tài)

圖3 光學(xué)顯微鏡下KL-1的菌體形態(tài)

表1 KL-1生理生化特性

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.2.3分子生物學(xué)鑒定

擴(kuò)增出拮抗細(xì)菌KL-1的16S rDNA片段序列全長為1 483 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性分析，結(jié)果表明KL-1菌株與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的部分序列同源性達(dá) 99%以上。隨后利用 MEGA 7.0軟件構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果顯示 KL-1與解淀粉芽孢桿菌(KY357304.1)的遺傳距離最近，再一次證實(shí)生防菌KL-1屬于解淀粉芽孢桿菌。綜合以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以鑒定KL-1為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

2.3 菌株KL-1的生物學(xué)特性研究

2.3.1KL-1生長曲線

圖5為在600 nm波長下，經(jīng)過不同培養(yǎng)時(shí)間后KL-1培養(yǎng)液的吸光度。從圖5可看出，KL-1在LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為18 h時(shí)，培養(yǎng)液的吸光度值最大。KL-1在接種到LB培養(yǎng)液后的9 h內(nèi)處于對(duì)數(shù)生長期，9 h～21 h內(nèi)處于穩(wěn)定生長期，接種21 h后進(jìn)入衰老期?？梢娫摼L速度較快，接種后9 h～21 h內(nèi)菌量最多。

圖4 KL-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 KL-1生長曲線

2.3.2pH對(duì)KL-1生長的影響

圖6為在600 nm波長下，處于不同pH條件下培養(yǎng)24 h后KL-1培養(yǎng)液的吸光度。從圖6可看出，該菌在較大pH范圍內(nèi)都能生長，但pH對(duì)KL-1菌株生長影響明顯。其中pH在5～9范圍內(nèi)適宜KL-1的生長，而KL-1最適pH在7.0左右，可見該菌適宜在中性條件下生長。

圖6 pH對(duì)KL-1生長的影響

2.3.3溫度對(duì)KL-1生長的影響

圖7為在600 nm波長下，處于不同溫度條件下培養(yǎng)24 h后KL-1培養(yǎng)液的吸光度。從圖7可看出，溫度對(duì)菌株KL-1生長和繁殖有明顯的影響，在20 ℃～50 ℃范圍內(nèi)，KL-1生長和繁殖速率呈先上升后下降趨勢(shì)，最適溫度為37 ℃左右。

圖7 溫度對(duì)KL-1生長的影響

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)外報(bào)道了很多有關(guān)生防菌防治番茄采后病害的研究，包括酵母菌等真菌類和芽孢桿菌等細(xì)菌類[20,21]。真菌類如酵母菌L-1-6[22]對(duì)番茄早疫病的抑制效果為77.8%，酵母菌BS-316[23]對(duì)番茄灰霉病的抑制效果為84.92%，；細(xì)菌類如放線菌FX-03[24]對(duì)番茄早疫病的抑制效果為75.6%，白黑鏈霉菌T22[25]對(duì)番茄灰霉病的抑制效果為55.1%，芽孢桿菌W12和W118[26]對(duì)番茄青枯病的抑制效果為62.3%。已報(bào)道的這些生防菌均探究了對(duì)番茄采后常見某一種病原菌的抑制效果。

本研究從櫻桃番茄成熟紅果上分離的菌株KL-1 的抑菌范圍比較廣泛，可以同時(shí)抑制極細(xì)鏈格孢菌、黑曲霉、青霉菌、擬康寧木霉、鹽生枝孢霉、子囊菌和膠孢炭疽菌這七種番茄采后常見病原菌；其抑菌率較高，其中對(duì)黑曲霉的抑制率最大為81%，其他六種病原菌抑制率也均高于70%。通過觀察菌株形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定該菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，生長曲線表明在培養(yǎng)9 h內(nèi)生長最旺盛，最適生長pH為7.0，最適生長溫度為37 ℃。該拮抗菌株在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的抑菌效果，但其如何發(fā)揮抑菌作用，是否在番茄果實(shí)上也能表現(xiàn)出顯著的抑菌效果，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。