許海方 謝陳南 應晨怡 陳錫冰 楊受保

(紹興文理學院 生命科學學院，浙江 紹興 312000)

γ-氨基丁酸A受體相關蛋白(Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP)在多種組織中廣泛分布，能與多種胞內因子發(fā)生互作，高度調控自噬體的運輸[1-3]、自噬體的形成與成熟[4-6]、自噬通量的控制以及對雷帕霉素誘導細胞自噬[7-8]等過程，從而廣泛參與細胞和機體的多種重要的生理病理過程，如細胞凋亡[9-10]、免疫應答[11-12]和抗腫瘤[13-14]等.本文從分子生物學特性、互作蛋白及生物學功能等方面概述了GABARAP的研究進展.

1 GABARAP的分子生物學特性

1.1 GABARAP的家族

GABAA受體相關蛋白，屬于GABARAPLl、GABARAPL2、GABARAPL3、GABARAPL4、LC3(Microtubule associated protein 1 light chain 3)、酵母Apg8或Aut7p和線蟲LGGs蛋白構成的古老蛋白家族中的一員，這個家族蛋白的氨基酸序列從單細胞的酵母到多細胞的哺乳動物均高度保守，與泛素的三級結構高度相似，且所有的蛋白均可以進行細胞內運輸.目前對該家族的研究主要集中于酵母、人類和其他模式生物中.1999年Wang等[15]首次利用酵母雜交技術從人腦cDNA文庫中篩選并克隆了GABARAP基因.Kneussel等[16]對GABARAP基因進行克隆和表達分析，總結了GABARAP的進化地位.

1.2 GABARAP的結構

人源GABARAP蛋白由117個氨基酸組成，分子量約為14 kDa，在進化上高度保守.氨基酸序列比對顯示，GABARAP和微管相關蛋白(Microtubule associated protein，MAP)具有較高的同源性，并且都能與多種其他蛋白相結合[17].GABARAP由N-端亞結構域(1-26aa)和C-端結構域(27-117aa)組成，其中N-端亞結構域含有α1和α2螺旋，可以和微管蛋白結合；C-端和泛素的結構很相似，含有4鏈的β折疊和α1、α2兩個螺旋，可與GABAA受體結合[15].

1.3 GABARAP的分布與表達

GABARAP在心、腦、睪丸、卵巢和胰腺等多種組織、器官中廣泛分布，但其分布存在時間和空間上的差異.Wang等[15]用免疫學方法證明，GABARAP在神經元的胞體和突觸中均有分布，且在心、腦、肝臟和胰腺等組織中均有不同程度的表達.白榮耀[18]發(fā)現(xiàn)GABARAP在雜色鮑的各種組織中廣泛表達，在大部分組織中的表達均為中等強度，但在肝胰臟組織中表達量最高，在血細胞中表達量最低；在雜色鮑的胚胎和幼體的發(fā)育過程中也有表達，且存在時間和空間上的差異；且從受精卵到十六細胞期，GABARAP的表達比較穩(wěn)定，桑椹胚時期GABARAP的表達水平急劇上升，直到原腸胚時期GABARAP的表達水平達到了高峰，之后GABARAP的表達水平急劇下降至接近受精卵時期水平.李金玲等[19]發(fā)現(xiàn)從斑馬魚2個細胞的受精卵一直到受精后24小時的胚胎中，GABARAP都呈高表達狀態(tài)，且這個基因極有可能是母體的遺留物.

上述研究表明GABARAP在多種組織中廣泛分布，特別是在胚胎發(fā)育時期，GABARAP這種時間和空間上的差異表明其可能參與胚胎和幼體的發(fā)育過程，在生物體的生命過程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用.

2 GABARAP的互作蛋白

2.1 ATG13

自噬相關蛋白13(Autophagy-related protein 13，ATG13)，和ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1)、ULK2(Unc-51 like autophagy activating kinase 2)、FIP200及ATG101(Autophagy-related protein 101)等均為ULK自噬復合物的重要成員[20-21].Alemu等[22]用pulldown分析證明GABARAP蛋白可與ULK復合物發(fā)生互作，并且作為自噬開始階段的支架組裝在ULK復合體上，其中，ATG13與GABARAP亞家族有強相互作用.ATG13核心基序C-末端結構域的點突變會強烈地減少其與GABARAP的互作.特別是與核心基序相鄰的酸性殘基的存在對于其與GABARAP的有效互作至關重要.上述結果表明，GABARAP和ATG13之間的互作是直接的，而不是由ULK復合體的其他成員介導的，并且GABARAP和ATG13的互作在自噬結構的延伸和運輸?shù)倪^程中發(fā)揮著關鍵作用.

2.2 微管蛋白

GABARAP不僅在體內能和微管共定位，在體外也能和微管蛋白(Tubulin)相互結合.Wang等[15]發(fā)現(xiàn)GABARAP和微管相關蛋白1A和1B之間的序列高度相似，并且其蛋白N-端的35個氨基酸殘基含有微管蛋白的結合位點.Pulldown實驗證明，GABARAP可同時與GABAA受體及tubulin結合，促進GABAA受體在細胞膜上的聚集和定位.Coyle等[23]進一步將其與Tubulin的結合位點縮小到了GABARAP的第10～22個殘基上，并發(fā)現(xiàn)GABARAP的其它區(qū)域可以增加其與微管蛋白的聚合活性，特別是H2螺旋結構域.由此，我們推測GABARAP可通過與微管蛋白結合，來協(xié)助受體進行生命活動.

2.3 NSF

N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF)是一種ATP酶，在細胞內膜泡轉運過程中發(fā)揮著重要作用[24-25].Kittler等[26]直接將GABARAP綁定到NSF上，發(fā)現(xiàn)NSF和GABARAP復合物可以在神經元中被檢測到，并且這兩種蛋白在細胞內膜區(qū)室內共定位.同時，他們發(fā)現(xiàn)GABARAP可通過與NSF互作，調節(jié)胞內囊泡的運輸和胞吐過程，以釋放出大量的兒茶酚胺等免疫物質.這意味著GABARAP可通過與NSF的互作，參與GABAA受體由細胞質向膜上的運輸過程和機體的免疫應答反應.

2.4 DDX47

DEAD-boxhelicase 47(DDX47)是一種RNA解旋酶，參與rRNA加工、前體mRNA剪接、蛋白質翻譯、RNA降解以及細胞凋亡等重要的生物過程[27].Lee等[28]用免疫共沉淀篩選到了GABARAP的結合配偶體DDX47，并用酵母雙雜交系統(tǒng)進一步證實GABARAP和DDX47可發(fā)生相互作用.同時，他們發(fā)現(xiàn)將GABARAP和DDX47 cDNA共轉染到腫瘤細胞系中可誘導細胞凋亡.上述研究表明，GABARAP可通過與特定蛋白的互作，參與細胞增殖、自噬、凋亡及免疫反應等生物學過程.

2.5 Bcl-2

B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白被認為是細胞凋亡中的基本調節(jié)因子，對維持細胞和組織的穩(wěn)態(tài)至關重要[29-30].Ma等[31]用核磁共振證明了Bcl-2對GABARAP具有顯著的親和力，并且兩者的互作取決于與BH4區(qū)域相鄰的Bcl-2的三殘基區(qū)段(EWD).Pulldown實驗證明Bcl-2過度表達會導致GABARAP脂化水平顯著降低，從而使得細胞自噬過程中吞噬泡的延長、延伸等環(huán)節(jié)受到抑制.這些結果支持了GABARAP與Bcl-2復合物在細胞自噬與細胞凋亡中的調節(jié)作用，同時建立了細胞凋亡與自噬之間的潛在的復雜聯(lián)系，并將GABARAP定義為涉及這種復雜聯(lián)系的新型互作伙伴.

除了以上蛋白以外，GABARAP還與BNI3L(BCL2 interacting protein 3 like)、ATG4B、ULK1、MAPK15、ERK8、GABRG2(Gamma-aminobutyric acid(GABA)A receptor, gamma)、NBR1(NBR1 autophagy cargo receptor)、WDFY3(WD repeat and FYVE domain containing 3)、CALR(Calreticulin)、ATG7、RASF5(Ras association domain family member 5)、TBD2B(TBC1domain family member 2B)及NEDD4(NEDD4 E3 ubiquitin protein ligase)等蛋白相互作用，廣泛參與細胞的自吞噬、細胞凋亡、抑制腫瘤和癌癥、免疫反應、調節(jié)心血管系統(tǒng)、化學突觸的傳遞及蛋白質定位等生物學過程.

3 GABARAP蛋白的功能

3.1 調節(jié)細胞自噬

自噬是一種保守的細胞內降解方式，可以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，對維持細胞內的環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著不可或缺的作用.自噬的過程主要分為啟動階段、自噬體的延伸、成熟和降解階段，涉及超過40個自噬相關蛋白[32].其中，GABARAP蛋白是自噬的良好標記，在自噬體的形成和成熟過程中參與這些蛋白的調控.(1)自噬的起始階段：GABARAP蛋白可與ATG13、ULK1、ULK2和FIP200互作，并作為自噬開始階段的支架組裝在ULK復合體上.中心體GABARAP在饑餓條件下可運輸自噬結構，GABARAP通過特異性激活ULK復合體，調節(jié)自噬體形成過程中的高爾基體伴侶WAC(WW domain containing adaptor with coiled-coil)和GM130蛋白質，并將其從中心體運輸.此外，GABARAP還能和自噬體形成的上游調控因子MAPK15、ERK8發(fā)生相互作用，從而誘導自噬的起始.(2)吞噬泡的延長、延伸階段：GABARAP蛋白對于雙膜結構的延伸是不可或缺的.GABARAP具有氨基端螺旋和由具有疏水口袋的β-鏈組成的C-末端，其C端甘氨酸殘基被ATG4蛋白酶酶切后產生細胞質GABARAP-Ⅰ，再依次通過激活ATG7、ATG3(泛素E2樣酶)和ATG12復合物，將切割的GABARAP與磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)綴合產生GABARAP-Ⅱ，吸附在自噬體膜上，以促進膜融合、延伸[33-34].(3)吞噬泡將底物包裹的階段：GABARAP與ALFY(Autophagy-linked fyve protein)的結合是選擇性結合，是ALFY對LC3B募集所必需的，可組裝一些蛋白質到早期吞噬泡產生的位置，促進自噬前體的形成.此外，GABARAP也可通過與E3泛素連接酶相互作用調節(jié)線粒體自噬，與Dvl2(Dishevelled 2)結合，負調節(jié)Wnt通路[35-36].(4)自噬體形成與成熟階段：GABARAP介導自噬過程中PI4KIIα(Phosphatidylinositol 4-kinase type 2 alpha)靶向調節(jié)PtdIns4P(Phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase catalytic subunit type 2 alpha)依賴性自噬體-溶酶體的融合.PI4KIIα可產生磷酸肌醇4磷酸鹽(PI4P)，并將GABARAPs從核周高爾基體區(qū)域結合到自噬體，若GABARAP、PI4KIIα缺失或過度表達會引起自噬流的減少，從而導致自噬體的大量積聚[37-38].此外，GABARAP蛋白可通過HOPS(Homotypic fusion and vacuole protein sorting)與PLEKHM1(Pleckstrin homology domain containing protein family member 1)一起調節(jié)自噬體-溶酶體融合.更有趣的是，GABARAPL2和GABARAP蛋白的酶促和化學脂質化形式均可促進膜融合，而LC3的脂質化形式執(zhí)行類似功能的程度要比GABARAP低得多.與LC3亞家族相比，這一發(fā)現(xiàn)揭示了GABARAP亞家族在膜融合中的優(yōu)先作用[4].

上述研究表明，自噬體的形成和成熟等過程受到GABARAP蛋白的高度調控，GABARAP在細胞定位、自噬體的形成、自噬體的運輸、自噬體與溶酶體的融合、自噬通量的控制以及對雷帕霉素誘導細胞自噬等過程中均起到了關鍵性的作用.

3.2 調節(jié)細胞凋亡

細胞凋亡是真核細胞體內的基本穩(wěn)態(tài)過程之一，在發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，GABARAP家族成員不僅參與細胞的自噬過程，而且還與細胞凋亡有關.Salah等[11]用DMBA(7,12-dimethylbenz(a)anthracene)處理小鼠使之致癌，觀察乳腺上皮細胞和導管的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)相比于正常的小鼠，在GABARAP缺陷的小鼠體內的乳腺上皮細胞、巨噬細胞、B細胞、T細胞和導管的數(shù)量減少得更快，導管生長的長度也顯著短于所有其他組小鼠.這些結果表明將GABARAP缺陷的小鼠暴露在致癌物DMBA中時，通過誘導細胞凋亡，抑制了細胞的生長，并使得細胞死亡數(shù)量顯著增長.Lee等[28]發(fā)現(xiàn)共轉染GABARAP及其互作蛋白DDX47可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡.冉莉等[9]通過qPCR發(fā)現(xiàn)用白藜蘆醇處理乳腺癌細胞，可以抑制細胞內GABARAPL1的表達并誘導細胞凋亡.

上述研究提示了GABARAP在細胞凋亡中的調節(jié)作用，但其調節(jié)機制尚有待于進一步的探討.

3.3 在癌癥和腫瘤中的功能作用

近年來，越來越多的研究表明異常自噬與多種疾病和惡性腫瘤密切相關，因此研究自噬相關基因GABARAP與腫瘤的關系對于全面認識癌癥的發(fā)生發(fā)展機制有非常重要的意義.Salah等[11]發(fā)現(xiàn)經DMBA處理的GABARAP缺陷小鼠中，腫瘤的形成顯著下降.夏燕[13]和李瑞湘[39]發(fā)現(xiàn)GABARAPLl在肝癌和結腸癌組織中的表達水平顯著下調，并且其下調表達與乙肝病毒感染、肝炎史以及手術后生存時間有很強的關聯(lián)性；同時，過表達GABARAPL1蛋白可顯著抑制肝癌細胞的增殖.

上述研究為GABARAP參與體內腫瘤發(fā)生提供了有力證據(jù)，證實了GABARAP家族蛋白能夠顯著抑制癌細胞的無限增殖，與多種癌癥的臨床病理特征具有很強的關聯(lián)性.因此探討GABARAP與腫瘤的關系，對于全面認識癌癥的發(fā)生發(fā)展機制以及開發(fā)特異性GABARAP抑制劑作為腫瘤靶向治療的新型藥物具有非常重大的意義.

3.4 參與免疫應答

目前，許多自噬相關基因都已經被發(fā)現(xiàn)在免疫反應中發(fā)揮重要作用.Salah等[11]發(fā)現(xiàn)用DMBA處理GABARAP缺陷的小鼠后，淋巴細胞能產生更高水平的IL-2和IFN-γ，機體也能在短時間內產生大量促炎癥因子，如IL-1β和IL-6等，從而激活機體免疫系統(tǒng)，進行免疫應答.周智[40]分析了鰻弧菌刺激后中華絨螯蟹血淋巴細胞中EsGABARAP的時序表達情況，發(fā)現(xiàn)血淋巴細胞中EsGABARAP的表達水平顯著上調，高達空白對照組的7倍多.白榮耀[18]檢測了溶藻弧菌感染后雜色鮑血細胞和肝胰臟中SaGABARAP的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)SaGABARAP基因的表達在血細胞和肝胰臟中均顯著上調，但在這兩個不同的組織器官中表達上調的時間和程度不同.在血細胞中，SaGABARAP基因轉錄水平在溶藻弧菌感染3h后最高；而在肝胰臟中，SaGABARAP的表達水平則在溶藻弧菌感染24h后達到峰值.

上述研究表明，GABARAP與免疫反應存在著密切的關系.病原或外界抗原誘導刺激，能夠誘導GABARAP mRNA表達水平上調或促炎癥因子的產生，參與免疫應答.

4 結論

GABARAP是一類家族同源性很高，在進化上高度保守的蛋白，在促進GABAA受體聚集和定位，以及調節(jié)細胞自噬和凋亡、參與免疫應答、抑制腫瘤和癌癥等方面發(fā)揮著十分重要的作用.但目前有關GABARAP的研究主要集中在一些模式生物中，在無脊椎動物中的報道較少.對于GABARAP家族蛋白在自噬中的功能作用有較多的研究報道，但對其在細胞凋亡、免疫反應和抗腫瘤等方面的研究尚不夠深入，尤其對其作用的分子機制則鮮有報道.今后，首先從廣度上，相信會有更多不同進化地位生物體的GABARAP蛋白被鑒定并開展功能分析；其次，從深度上，利用CRISPR/Cas9、RNAi和免疫共沉淀等各種技術方法，有望探明GABARAP蛋白的功能作用及其詳細的分子機制，為利用GABARAP蛋白開展細胞自噬、凋亡與分子免疫等基礎研究，以及腫瘤等疾病的診治提供新思路、新靶點.