宋紹征，陸 睿，張 婷,潘生強，成 勇，周鳴鳴*

(1.無錫太湖學院 護理學院， 江蘇 無錫 214000；2.揚州大學 獸醫(yī)學院 江蘇省轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇食品藥品職業(yè)技術學院，制藥工程學院，江蘇 淮安 223003)

從20世紀70年代開始，轉(zhuǎn)基因動物技術逐漸成為生物醫(yī)學研究最廣泛的手段之一[1]。通過轉(zhuǎn)基因技術將預先設計的外源基因?qū)雱游锛毎蚺渥觾?nèi)，構建整合有外源基因的重構胚來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物[2]。目前，制備轉(zhuǎn)基因動物的方法較多，最常見的是顯微注射和體細胞核移植[3-5]。自1997年英國科學家WILMUT等[6]獲得了世界首例體細胞克隆羊“多莉”以來，體細胞核移植迅速成為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物應用最廣泛的一種技術。該方法主要是通過細胞轉(zhuǎn)染將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的動物體細胞，篩選鑒定后將陽性整合細胞株作為供核細胞進行動物克隆，已經(jīng)成功地在牛、羊、豬、兔和小鼠等多種轉(zhuǎn)基因動物中應用[7-13]。

通過體細胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動物的前提是獲得可控性的供核細胞，胎兒成纖維細胞具有全能干細胞潛能，容易分離獲得和培養(yǎng)轉(zhuǎn)染，是一種比較合適的供核細胞[14]。但原代胎兒細胞的體外培養(yǎng)傳代次數(shù)也是有限的，山羊胎兒成纖維細胞有40～120個細胞分裂代次[15-16]。長期的體外轉(zhuǎn)染、篩選和傳代培養(yǎng)，將會導致細胞變得衰老，活力和生長潛能下降，同時也增加了遺傳突變幾率。2次克隆是指通過剖宮產(chǎn)獲取克隆胎兒細胞進行的再次動物克隆，避免了供核細胞長期體外培養(yǎng)所造成的老化現(xiàn)象。根據(jù)相關研究報道[17-19]，利用轉(zhuǎn)基因克隆動物的胎兒成纖維細胞作為供核細胞進行再克隆，能夠提高重構胚的發(fā)育率和受體妊娠率，挽救早期可能隱性流產(chǎn)的胎兒，從而提高轉(zhuǎn)基因動物的制備效率。

因此，本研究應用體細胞核移植技術制備LYZ和Blac轉(zhuǎn)基因山羊，并通過2次克隆的方法來再次制備轉(zhuǎn)基因山羊，比較2次克隆的轉(zhuǎn)基因山羊重構胚發(fā)育情況，旨在為今后高效生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊和轉(zhuǎn)基因動物遺傳育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒BLYZ質(zhì)粒菌種(圖1A，含山羊BLG調(diào)控序列、LYZ cDNA、NEO基因、CMV增強子等)，Blac質(zhì)粒菌種(圖1B，山羊BLG調(diào)控序列、hα-LA cDNA、NEO基因、CMV增強子等)以及宿主菌DH5α均由本實驗室保存。

圖1 BLYZ和Blac乳腺特異性表達載體結構示意圖

1.2 引物本研究所有的PCR引物均借助于Primer Premier 5.0軟件設計完成，由上海生工生物工程技術有限公司合成(表1)。

表1 檢測所用引物

1.3 主要試劑DMEM/F12 (Hyclone，CatNo.D2906)、G418(Amesco,CatNo.0344)、FBS (Hyclone，CatNo.SH30070.03)、Trypsin (Amresco，Cat No.0458)、促黃體素釋放激素(LHRH，Cat No.20071203)、氯前列烯醇(PG，Cat No.070102)和促卵泡生長激素(FSH，Cat No.20080509)均購自寧波激素廠；M2、M16、青鏈霉素、透明質(zhì)酸酶、細胞松弛素B、核熒光染料Hochest 33342、6-甲基氨基蝶呤、離子霉素等均購自美國Sigma公司；DNA 膠純化回收試劑盒購自QIAGEN 公司；各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；其他未說明試劑均為國產(chǎn)分析純，分別購自上海藥劑有限公司、上海生工生物工程有限公司和南京生興生物有限公司。

1.4 實驗動物試驗中使用的薩能奶山羊和徐淮白山羊均來自于揚州大學實驗農(nóng)牧場，常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.5 山羊胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)無菌手術剖宮產(chǎn)獲取35日齡奶山羊胎兒，D-Hank’s緩沖液洗滌2次，去除頭、四肢和內(nèi)臟團，剪碎剩下組織成約1 mm3大小，D-Hank’s緩沖液洗滌2次后，置于潔凈離心管內(nèi)，添加5 mL消化液 (含0.05% 胰酶 + 0.04% EDTA)，移液管反復吹打消化15 min，靜置1 min，取上層渾濁液于另一潔凈離心管，D-Hank’s緩沖液離心洗滌3次。細胞計數(shù)并用正常培養(yǎng)液 (含DMEM/F12+10% FBS) 調(diào)整密度至 5×105個/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液。剩余未消化組織按照上述步驟繼續(xù)消化至組織塊基本消失。

1.6 轉(zhuǎn)基因細胞株的建立待山羊胎兒成纖維細胞生長匯合至約80%時，收集細胞進行轉(zhuǎn)染。BLYZ和Blac乳腺特異性表達載體經(jīng)SalⅠ、NotⅠ雙酶切線性化和QIAGEN試劑盒純化后，分別與細胞懸液混合，用電轉(zhuǎn)染液調(diào)整細胞密度為1×106個/mL、基因終質(zhì)量濃度為20 mg/L時，開始電轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染條件為2 mm間隙電極杯、2.0 kV/cm、300 μs、電擊2次，靜置2 min。轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)液 (含DMEM/F12+10% FBS) 中，接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。同時設置未轉(zhuǎn)染的正常細胞作陰性對照。轉(zhuǎn)染48 h后，添加含500 mg/L的G418培養(yǎng)液進行篩選培養(yǎng)，每2 d換液1次。篩選培養(yǎng)10～14 d后，即所有正常細胞對照組均死亡時，挑取單克隆細胞株于48孔板內(nèi)，更換正常培養(yǎng)液 (含DMEM/F12+10% FBS) 繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)傳代于12孔板內(nèi)擴大培養(yǎng)。待細胞生長匯合到約80%～90%時，收集細胞，其中一部分細胞凍存 (含DMEM/F12 + 10% DMSO + 20% FBS) 以作體細胞核移植的供核細胞；另一部分細胞提取DNA以作PCR檢測。應用CMV-LYZ-F/R引物進行人溶菌酶基因整合檢測，應用CMV-LA-F/R引物進行人α-乳白蛋白基因整合檢測，引物序列見表1。

1.7 供質(zhì)羊和受體羊的準備選取正常成年雌性徐淮白山羊作為供質(zhì)羊，查情后9～13 d開始肌肉注射FSH，連續(xù)3 d，每天早晚各1次，總劑量300 IU/只。第4天肌肉注射氯前列烯醇0.1 mg/只，第5天肌肉注射LHRH 100 μg/只。同步發(fā)情處理寄母羊。

1.8 核移植、融合與激活37℃復蘇冷凍細胞后，置于12孔板內(nèi)以正常培養(yǎng)液(含DMEM/F12+10% FBS)培養(yǎng)至細胞匯合度達到80%左右時，更換為含0.5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，饑餓培養(yǎng)48 h，使用M2溶液收集細胞備用。卵母細胞置于含7.5 mg/L CB和 5 mg/L Hochest 33342的M2溶液中處理0.5 h，在熒光倒置顯微鏡下去除第一極體和細胞核后，移入供核細胞，形成重構卵。

重構卵在M16溶液中培養(yǎng)30 min后，進行融合，融合液為0.3 mmol/L甘露醇+0.05 mmol/L 氯化鈣+0.05 mmol/L 硫酸鎂+2% BSA，融合參數(shù)為1.0 kV/cm、50 μs、2個脈沖。M16溶液培養(yǎng)0.5 h 后觀察，未融合卵進行二次融合。

融合卵在M16溶液中培養(yǎng)5 h后，開始激活(激活液：M16培養(yǎng)液+7.5 mg/L CB +5 μmol/L 離子霉素)，精確控制5 min,然后在含7.5 mg/L CB 和2 mmol/L 6-DMAP的M16溶液中培養(yǎng)5 h,最后轉(zhuǎn)移到正常M16溶液中培養(yǎng)，直到胚胎移植[14]。

1.9 胚胎移植與妊娠診斷第2天觀察重構胚發(fā)育情況，挑取發(fā)育至2～4細胞的重構胚通過無菌手術移植入同步發(fā)情的寄母山羊輸卵管內(nèi)，每只受體山羊移植4～10枚胚胎，經(jīng)30～35 d后進行B超妊娠診斷，妊娠羊統(tǒng)一加強飼養(yǎng)管理。

1.10 胎兒細胞的再克隆挑取B超診斷為妊娠的山羊，無菌手術剖宮產(chǎn)獲取35日齡轉(zhuǎn)基因克隆胎兒，按照1.5的方法獲得細胞系，通過PCR進行外源基因整合檢測，應用CMV-LYZ-F/R引物進行溶菌酶基因整合檢測，應用CMV-LA-F/R引物進行人α-乳白蛋白基因整合檢測。確定胎兒細胞整合外源基因后，凍存細胞(DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO)保存于液氮中備用。

37℃復蘇胎兒細胞，按照1.7、1.8和1.9的方法分別重新制備LYZ和hα-LA轉(zhuǎn)基因山羊,30～35 d 后進行B超診斷，妊娠山羊定期復檢，加強飼養(yǎng)管理直至分娩。

2 結果

2.1 山羊胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)利用胰蛋白酶消化獲得的山羊胎兒成纖維細胞屬于一種貼壁細胞，形態(tài)較小，呈梭形長條狀、渦旋狀、放射狀或不規(guī)則狀。肉眼可見細胞群內(nèi)有散落的白色集落形成，密度過大時細胞相互擠壓呈細長條狀，典型的山羊胎兒成纖維細胞如圖2所示。

圖2 山羊胎兒成纖維細胞(100×)

2.2 轉(zhuǎn)基因細胞株的獲得BLYZ和Blac載體分別電轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞2×106個，經(jīng)G418篩選，BLYZ載體獲得83株藥物抗性細胞，Blac獲得69株藥物抗性細胞。應用CMV-LYZ-F/R引物進行LYZ基因整合檢測，獲得74株LYZ轉(zhuǎn)基因細胞，PCR擴增產(chǎn)物大小均為852 bp(圖3)。應用CMV-LA-F/R引物進行hα-LA基因整合檢測，獲得62株hα-LA轉(zhuǎn)基因細胞，PCR擴增產(chǎn)物大小均為843 bp(圖4)。

圖3 部分LYZ基因整合檢測PCR圖 M.DL2000 DNA Marker;P.BLYZ vector;N.Untransfected normal cells;B.Blank control;1～21.transfected cell samples

圖4 部分hα-LA基因整合檢測PCR圖 M.DL2000 DNA Marker;P.Blac vector;N.Untransfected normal cell;B.Blank control;1～17.transfected cell samples

2.3 重構胚的發(fā)育情況與轉(zhuǎn)基因克隆胎兒驗證BLYZ載體共超排獲得382枚山羊卵母細胞，去核卵296枚，去核率為77.5%(296/382)；融合后獲得235枚重構卵，融合率為79.4%(235/296)；激活后培養(yǎng)至第2天觀察，發(fā)育為2～4細胞的重構胚有84枚，發(fā)育率為35.7%(84/235)；挑取2～4細胞的重構胚移植入13只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進行B超妊娠診斷，5只妊娠，妊娠率為38.5%(5/13)，見表2。

Blac載體共超排獲得353枚山羊卵母細胞，去核卵287枚，去核率為81.3%(287/353)；融合后獲得221枚重構卵，融合率為77.0%(221/287)；激活后培養(yǎng)至第2天觀察，發(fā)育為2～4細胞的重構胚有73枚，發(fā)育率為33.0%(73/221)；挑取2～4細胞的重構胚移植入11只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進行B超妊娠診斷，4只妊娠，妊娠率為36.4%(4/11)，見表2。

分別無菌手術剖宮產(chǎn)獲取35日齡BLYZ克隆胎兒和Blac克隆胎兒各1只(圖5)，并建立細胞系，PCR檢測驗證該2只克隆胎兒及建立的細胞系均為轉(zhuǎn)基因克隆胎兒，如圖6所示。

表2 體細胞核移植生產(chǎn)LYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒統(tǒng)計(含二次克隆)

圖5 35日齡的BLYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒圖片

圖6 BLYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒整合檢測PCR圖 M.DL2000 DNA Marker;P.BLYZ vector;N.Untransfected normal cells;B.Blank control;1～21.transfected cell samples

2.4 2次克隆重構胚的發(fā)育情況剖宮產(chǎn)獲取的35日齡BLYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒建立細胞系進行的2次克隆重構胚發(fā)育情況詳見表2，分別超排獲得172和190枚山羊卵母細胞，去核卵分別為131枚和145枚，去核率分別為76.2%(131/172)和76.3%(145/190)；融合后分別獲得118枚和127枚重構卵，融合率分別為90.1%(118/131)和87.6%(127/145)；激活后培養(yǎng)至第2天觀察，發(fā)育為2～4細胞的重構胚分別有79枚和87枚，發(fā)育率分別為66.9%(79/118)和68.5%(87/127)。挑取2～4細胞的BLYZ重構胚移植入12只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進行B超妊娠診斷，7只妊娠，妊娠率為58.3%(7/12)；挑取2～4細胞的Blac重構胚移植入13只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進行B超妊娠診斷，8只妊娠，妊娠率為61.5%(8/13)。通過2次克隆獲得的轉(zhuǎn)基因重構胚融合率、發(fā)育率和移植受體妊娠率均明顯高于傳統(tǒng)的體細胞核移植。

3 討論

動物轉(zhuǎn)基因技術主要包括顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載體法、胚胎干細胞介導法、體細胞核移植法等，能夠打破種間隔離，使特定的基因按照人類的要求在不同物種間進行交流，是生命科學研究最常見的技術之一，已在基因表達調(diào)控研究、人類疾病模型制作、人體器官生產(chǎn)與器官移植、動物生物反應器、動物品種改良等方面得到了廣泛的應用[20]。體細胞核移植是目前生產(chǎn)大中型轉(zhuǎn)基因動物應用最廣泛的一種方法[5]，大部分體細胞核移植的供核細胞均來自于長期的體外培養(yǎng)，存在細胞生長潛能下降、容易老化等缺陷，影響重構胚的融合和發(fā)育情況，且出生的轉(zhuǎn)基因動物健康狀況也存在一定的風險，最終導致生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆動物的效率低下。因此，如何積極探索一種能夠保持供核細胞活力的方法至關重要。

本研究采用2次克隆來再次制備轉(zhuǎn)基因動物，無論在重構胚的融合率、發(fā)育率還是移植受體妊娠率方面均明顯高于傳統(tǒng)的體細胞核移植，這一結果提示應用2次克隆法制備轉(zhuǎn)基因動物是高效可行的。該方法主要是直接利用克隆胎兒建立的細胞系作為供核細胞來進行核移植制備轉(zhuǎn)基因動物，這樣供核細胞在體外培養(yǎng)時間較短，也無需轉(zhuǎn)染、克隆化篩選和檢測等繁瑣程序，細胞能夠保持原有的生長潛能，活力較高，可使其具有重編程潛能在重構胚胎后發(fā)育到完整個體，挽救早期隱性流產(chǎn)的胎兒，提高轉(zhuǎn)基因動物制作效率[21-22]。BRESSAN等[17]比較了以長時間體外篩選培養(yǎng)的整合外源基因的豬胎兒成纖維細胞作為供核細胞進行的第1輪克隆和以克隆胎兒細胞系作為供核細胞的2次克隆情況，發(fā)現(xiàn)2次克隆的重構胚發(fā)育率和移植受體的妊娠率明顯提高。FUJIMURA等[18]報道，在基因打靶動物的制作中，通過2次連續(xù)再克隆能有效提高基因打靶動物制作的效率。AHN等[19]報道了通過2次再克隆挽救了在第1輪克隆中出生后死亡的基因打靶動物，從而使具有珍貴基因型的動物復活。2次克隆雖然能夠提高轉(zhuǎn)基因動物的制作效率，但是在轉(zhuǎn)基因山羊中的應用報道較少。

本研究通過電轉(zhuǎn)染法分別獲得LYZ轉(zhuǎn)基因細胞74株、hα-LA轉(zhuǎn)基因細胞62株。第1輪通過這種長期體外篩選培養(yǎng)的細胞作為供核細胞制備轉(zhuǎn)基因山羊，其中BLYZ載體的重構卵融合率為79.4%(235/296)，2～4細胞的發(fā)育率為35.7%(84/235)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為38.5%(5/13)；Blac載體的重構卵融合率為77.0%(221/287)，2～4細胞的發(fā)育率為33.0%(73/221)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為36.4%(4/11)。以剖宮產(chǎn)獲取克隆胎兒建立的細胞系作為供核細胞制備轉(zhuǎn)基因山羊的2次克隆法，BLYZ載體的重構卵融合率為90.1%(118/131)，2～4細胞的發(fā)育率為66.9%(79/118)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為58.3%(7/12)；Blac載體的重構卵融合率為87.6%(127/145)，2～4細胞的發(fā)育率為68.5%(87/127)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為61.5%(8/13)。綜上結果所示，首輪體細胞核移植制備轉(zhuǎn)基因山羊的重構胚發(fā)育率和受體妊娠率平均為34.4%和37.5%，而通過2次克隆再次核移植制備轉(zhuǎn)基因山羊的重構胚發(fā)育率和受體妊娠率平均為67.8%和60.0%，明顯高于傳統(tǒng)的體細胞核移植。此外，本研究中設計了2種基因(BLYZ和Blac)進行比較研究，發(fā)現(xiàn)基因之間無明顯差異，這2種轉(zhuǎn)基因的2次克隆法均明顯高于傳統(tǒng)的第1輪體細胞核移植法。這與其他學者在不同動物中的2次連續(xù)克隆研究報道相吻合[17-19,23]。

總之，本研究對第1輪體細胞核移植和2次克隆的重構胚發(fā)育情況進行了比較分析，結果表明2次克隆法獲得的重構胚融合率、發(fā)育率和受體妊娠率均顯著高于傳統(tǒng)的體細胞核移植法，其中發(fā)育率和妊娠率分別高達67.8%和60.0%。這為今后大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊和其他轉(zhuǎn)基因動物提供了科學依據(jù)，也為轉(zhuǎn)基因動物遺傳育種奠定扎實的基礎。