王建強(qiáng)，李 俊，馬曉敏，崔璐瑩，孟 霞，李建基，王 亨*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

奶牛乳腺炎是由各類(lèi)病因引起的乳腺炎癥，其特征在于乳汁的物理、化學(xué)和細(xì)菌學(xué)變化，以及乳腺組織的病理變化，并嚴(yán)重影響著乳汁的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。奶牛乳腺內(nèi)感染通常由病原微生物引起，目前已知的能引起奶牛乳腺炎的病原微生物有150種之多[2]。比較常見(jiàn)的有金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌、克雷伯菌、鏈球菌等，其中以金黃色葡萄球菌較為常見(jiàn)，且可造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，不易被清除[3]。

核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是氧化還原反應(yīng)的主要調(diào)控途徑。Nrf2信號(hào)通路調(diào)控某些主要的抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶基因的編碼，例如谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)、硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1)、血紅素加氧酶1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO-1)等[4]，因此，Nrf2信號(hào)通路在細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的過(guò)程中起著重要的作用。有研究表明,熱應(yīng)激情況下奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)內(nèi)Nrf2及下游基因NQO-1表達(dá)升高以抵抗熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。另有研究表明，脂多糖(LPS)與脂磷壁酸(LTA)刺激均可引起Nrf2下游基因HO-1和GCLM的上調(diào)[5]，但Nrf2信號(hào)通路是否參與了S.aureus誘導(dǎo)的BMECs損傷仍不明確。核因子κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，是免疫系統(tǒng)正常發(fā)育、特異性免疫和非特異性免疫中所必須的，也是介導(dǎo)炎癥的主要信號(hào)通路[6-7]。有研究顯示，S.aureus感染24 h上調(diào)了小鼠乳腺內(nèi)TNF-α和IL-6的表達(dá)[8]，同時(shí)，S.aureus感染BMECs 1 h后，NF-κB通路被顯著激活[9]。但在S.aureus感染BMECs過(guò)程中，炎性因子及NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)是否存在差異目前仍有待研究。本試驗(yàn)旨在通過(guò)體外建立的S.aureus感染BMECs模型，觀察S.aureus侵襲過(guò)程中，Nrf2和NF-κB信號(hào)通路主要相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化，以及對(duì)炎性因子表達(dá)的影響，為探討奶牛乳腺炎的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備原代BMECs由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院外科課題組進(jìn)行原代培養(yǎng)、純化、鑒定與保存；S.aureus(ATCC 29213)，購(gòu)自美國(guó)典型菌種保存中心；無(wú)內(nèi)毒素胎牛血清(Gibco，美國(guó))；DMEM/F-12培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國(guó))；胰蛋白酶(Amresco，美國(guó))；兔源Nrf2抗體(Abcam，USA)；兔源β-actin、p65、P-p65、IκBα、P-IκBα抗體、山羊抗兔二抗(CST，美國(guó))；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光染料預(yù)混液、ECL發(fā)光液(諾唯贊，中國(guó))；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(碧云天，中國(guó))；PVDF膜(Millipore，德國(guó))；蛋白電泳系統(tǒng)、PCR擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 原代BMECs的分離與培養(yǎng)原代BMECs為本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)酶消化法分離鑒定所得[10]。無(wú)菌采集健康的荷斯坦奶牛的乳腺組織，裁切成3 cm3左右立方小塊，用含有300 IU/mL青鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗后，置于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理。用PBS反復(fù)清洗后，剪切成糊狀，重懸洗滌，直至上清液清亮。用0.25%的Ⅱ型膠原酶按2∶1重懸組織，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化2～3 h。依次用20和80目的篩網(wǎng)過(guò)濾消化液，1 600 r/min離心6 min，收集細(xì)胞團(tuán)塊。使用PBS重懸并清洗細(xì)胞團(tuán)塊3次后，使用DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞團(tuán)塊并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%培養(yǎng)瓶底面后，利用差時(shí)消化法純化BMECs。

1.3S.aureus的培養(yǎng)將S.aureus(ATCC 29213)接種至血液瓊脂培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)10 h,挑取單個(gè)菌落接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床中以120 r/ min培養(yǎng)至平臺(tái)期。按1∶100轉(zhuǎn)接至20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床中以120 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，根據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)備用。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)炎性因子和Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)將細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種至六孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合80%后更換無(wú)血清培養(yǎng)液；S.aureus按MOI = 1∶1侵染細(xì)胞。于感染后0，0.5，1，2，3，4，6，8 h提取RNA檢測(cè)炎性因子；同時(shí)于感染后0，2，4，6，8 h提取RNA檢測(cè)Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平。方法如下：使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR檢測(cè)Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵基因Nrf2，Keap1和NQO-1，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表達(dá)量。引物如表1所示，每個(gè)樣本重復(fù)3次，并以β-actin為參照，按照2-△△Ct法計(jì)算出每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 Western blot檢測(cè)Nrf2蛋白和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平將BMECs按106個(gè)/孔接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞匯合80%以上后更換無(wú)血清培養(yǎng)液；S.aureus按MOI = 1∶1侵染細(xì)胞。于感染后0，1，2，4，6，8 h提取蛋白檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá)量；于感染后0，0.5，1，2，3，4，5，6 h提取蛋白檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p65，P-p65，IκBα和P-IκBα表達(dá)量。方法如下：BCA法調(diào)整蛋白濃度，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，在5%脫脂乳內(nèi)室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗PVDF膜后，在二抗內(nèi)室溫孵育2 h，顯影后，通過(guò)灰度值對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1S.aureus侵染對(duì)Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響S.aureus侵染BMECs后，Nrf2基因在侵染的2，4 h表達(dá)呈極顯著上升(P<0.01)，且在6，8 h 時(shí)呈極顯著下降(P<0.01)(圖1A)；Keap1基因表達(dá)在侵染的2，4 h呈顯著或極顯著下降(P<0.05 或P<0.01)，且在侵染的8 h呈顯著上升(P<0.05)(圖1B)；NQO-1基因在侵染后2，4 h表達(dá)呈顯著或極顯著上升(P<0.05或P<0.01)(圖1C)。故，S.aureus侵染細(xì)胞2，4 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號(hào)通路被激活，細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平提升；而在侵染的6，8 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號(hào)通路被抑制，細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平下降。

圖1 S.aureus侵染BMECs對(duì)Nrf2通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 A.Nrf2相對(duì)表達(dá)量；B.Keap1相對(duì)表達(dá)量；C.NQO-1相對(duì)表達(dá)量。注：與0 h相比，*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。下同

2.2S.aureus侵染對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-8基因表達(dá)的影響S.aureus侵染BMECs 1，2，3，4，6，8 h后，TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)(圖2)；故S.aureus侵染細(xì)胞后，可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的炎性因子的合成和釋放。

圖2 S.aureus侵染BMECs對(duì)炎性因子基因mRNA表達(dá)的影響 A.TNF-α相對(duì)表達(dá)量；B.IL-1β相對(duì)表達(dá)量；C.IL-8相對(duì)表達(dá)量

2.3S.aureus侵染對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響S.aureus侵染BMECs 2 h后，Nrf2蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，而在侵染后的6，8 h，Nrf2蛋白表達(dá)量呈顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)(圖3)；故Nrf2信號(hào)通路在感染后2 h時(shí)被激活，而在感染后6，8 h時(shí)被抑制。

2.4S.aureus侵染對(duì)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響S.aureus侵染BMECs 0.5，1，2，3，4，5，6 h后，p65磷酸化水平呈顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)(圖4)；IκBα磷酸化水平在感染后1，2，3，4 h呈顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；故S.aureus侵染BMECs后，可激活NF-κB信號(hào)通路。

圖3 S.aureus侵染BMECs對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)的影響 A.Western blot檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá)結(jié)果；B.Nrf2相對(duì)表達(dá)量

圖4 S.aureus侵染BMECs對(duì)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 A.Western blot檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)結(jié)果；B.p65磷酸化水平；C.IκBα磷酸化水平

3 討論

Nrf2信號(hào)通路是細(xì)胞氧化還原的主要調(diào)控通路，在生理?xiàng)l件下，Keap1通過(guò)泛素化降解Nrf2，從而抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性[4]。而在自由基和病原的刺激下，Nrf2在DJ-1蛋白的作用下被釋放并入核，Nrf2與抗氧化元件(ARE)結(jié)合后激活下游靶基因的表達(dá)[11-12]。SUN等[13]還發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)恢復(fù)后，Keap1重新入核并從ARE中釋放Nrf2，將Nrf2運(yùn)輸回胞漿中。對(duì)Nrf2基因缺失小鼠模型的研究表明，Nrf2的缺失可能會(huì)加重S.aureus引起的敗血癥和急性肺損傷，這說(shuō)明了Nrf2信號(hào)通路在S.aureus感染過(guò)程中的重要性[14-15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在S.aureus感染后2 h，細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高，Nrf2、NQO-1基因顯著上調(diào)，Keap1基因顯著下調(diào)，表明S.aureus刺激激活了Nrf2信號(hào)通路，釋放下游解毒酶；而在感染后6，8 h時(shí)，Nrf2表達(dá)受到抑制，說(shuō)明此時(shí)S.aureus抑制了Nrf2信號(hào)通路的表達(dá)。JI等[16]發(fā)現(xiàn)使用LPS作用于細(xì)胞24 h后Nrf2蛋白表達(dá)量顯著降低；另有研究指出，LPS似乎對(duì)Nrf2的表達(dá)無(wú)影響[17]；然而，低劑量的LPS誘導(dǎo)了Nrf2信號(hào)通路激活[18]，因此，Nrf2信號(hào)通路的激活可能與LPS的劑量和作用時(shí)間有關(guān)。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)在S.aureus感染初期，細(xì)胞通過(guò)激活Nrf2途徑上調(diào)解毒酶基因(如NQO-1)的表達(dá),而在感染后期Nrf2信號(hào)途徑可能受到抑制，表明此時(shí)抗氧化系統(tǒng)受到損傷。這也與曾慰等[19]觀察到的結(jié)果相似。

NF-κB信號(hào)通路對(duì)免疫的主要調(diào)節(jié)作用分為經(jīng)典通路與非經(jīng)典通路。通常情況下，p65與p50構(gòu)成的NF-κB異二聚體被IκB蛋白結(jié)合，從而使NF-κB結(jié)合DNA的特性被抑制。當(dāng)宿主受到病原侵襲時(shí)，病原被模式識(shí)別受體(PAMP)識(shí)別，NF-κB通路被激活，IκB蛋白在IκB激酶的作用下發(fā)生磷酸化并與p65/p50二聚體解離，該二聚體核轉(zhuǎn)位并作用于相應(yīng)的靶基因[6-7]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在S.aureus侵染BMECs后，p65與IκBα蛋白的磷酸化水平明顯上升，表明NF-κB通路被激活，p65與IκB蛋白分離并入核表達(dá)。這與吳建美等[20]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相符。

TNF-α是一種具有多生物功能的小分子蛋白，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性因子TNF-α與膜受體結(jié)合，促進(jìn)了IκB蛋白磷酸化，進(jìn)一步介導(dǎo)p65蛋白的入核[21]。IL-1β是炎癥發(fā)生早期的重要促炎因子，可由多種細(xì)胞分泌[22]，IL-1β能夠提高細(xì)胞組織對(duì)TNF-α的敏感程度，同時(shí)刺激其他炎性因子產(chǎn)生，進(jìn)一步放大炎性作用[23]。IL-8是一類(lèi)趨化因子，可特異性趨化炎癥細(xì)胞，是各種免疫細(xì)胞游走至炎癥發(fā)生部位的關(guān)鍵因子[24]。關(guān)立增等[25]發(fā)現(xiàn)，S.aureus感染上調(diào)了BMECs內(nèi)IL-6和IL-8的表達(dá)。在本試驗(yàn)中，在S.aureus感染后的1～8 h，BMECs內(nèi)的TNF-α、IL-1β與IL-8的表達(dá)水平均顯著升高，從而進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)炎性的發(fā)生。WANG等[26]研究表明，S.aureus誘導(dǎo)BMECs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)，同時(shí)NF-κB信號(hào)通路被激活，這與本試驗(yàn)觀察的結(jié)果相一致。

綜上所述，S.aureus感染BMECs后，激活了Nrf2和NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)炎性因子的表達(dá)和釋放，說(shuō)明Nrf2和NF-κB信號(hào)通路可能參與了S.aureus對(duì)BMECs的氧化和損傷過(guò)程，為探討奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)制和防控提供了理論依據(jù)。