李常紅，趙寒冬， 程云云，郝林琳 ，滕肇慧

(1.白城師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 白城 137000；2.長春農(nóng)業(yè)博覽園,吉林 長春 130117；3.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062；4.大連摩格生物科技有限公司，遼寧 大連 116023)

動(dòng)物的生長是一個(gè)復(fù)雜的生物代謝過程，受多種因素的影響，包括環(huán)境變化、營養(yǎng)供給、遺傳基因、激素調(diào)節(jié)等。各種因素對(duì)生長的調(diào)節(jié)最終是通過下丘腦-垂體-胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)生長軸來調(diào)控實(shí)現(xiàn)的[1-3]。據(jù)報(bào)道GH是一種由垂體合成分泌的單一肽類激素，其呈脈沖式釋放后主要與肝細(xì)胞表面的GHR 結(jié)合，經(jīng)過JAK2/STAT5途徑激活下游信號(hào)傳導(dǎo)和靶基因轉(zhuǎn)錄[4]，產(chǎn)生IGF1。IGF1與IGF1R結(jié)合后通過多種信號(hào)通路而發(fā)揮促進(jìn)生長和調(diào)節(jié)代謝的作用。

microRNAs (miRNAs)作為一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的非編碼小RNA分子，在動(dòng)物體內(nèi)主要是通過靶向mRNA 的3′UTR 發(fā)揮作用。它們通過這種方式參與調(diào)控大量生物功能和進(jìn)程，如發(fā)育、分化、代謝、生長、增殖和細(xì)胞凋亡，近年來它們成為分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。miRNAs的研究在各領(lǐng)域都取得了重要進(jìn)展，人們對(duì)miRNAs的研究也更加深入。哺乳動(dòng)物miRNAs的研究已經(jīng)涉及多個(gè)組織/器官，關(guān)于垂體miRNAs的研究也取得了一些重要進(jìn)展。

研究表明，大量非編碼RNAs參與調(diào)控IGFs的表達(dá)進(jìn)而影響機(jī)體生理和病理效應(yīng)。LIU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，出生后70 d豬肝臟中IGF1的表達(dá)水平是胚胎70 d時(shí)的26.6倍，并從miRNA調(diào)控方面探討了豬不同發(fā)育階段肝源性IGF1差異表達(dá)的原因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-18b和miR-130b-3p可能是導(dǎo)致IGF1在不同發(fā)育階段肝臟中表達(dá)差異的部分原因。KAMRAN等[6]證實(shí)在青少年時(shí)期，miR-29的高表達(dá)降低了多種促進(jìn)生長基因(包括肝臟IGF-1)的表達(dá)，從而導(dǎo)致生長發(fā)育緩慢。IGF1是肝細(xì)胞癌中的一個(gè)hub基因，也是肝癌組織與正常組織相比上調(diào)最多的基因之一，miR-379通過靶向其受體基因IGF1R并抑制其表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[7]。研究發(fā)現(xiàn)miR-511通過靶向豬IGF1基因，降低IGF1表達(dá)水平及相關(guān)通路因子(MAPK/ERK及PI3K/Akt)的表達(dá)，并抑制PK-15細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡[8]。大量研究表明垂體中miRNAs與動(dòng)物生長調(diào)控密切相關(guān)。ZHANG等[9]通過microarray檢測了大鼠垂體中的miRNAs，其中miR-709在大鼠垂體中高表達(dá)且可能參與生長調(diào)控過程。因此，本試驗(yàn)旨在明確垂體miR-709與關(guān)鍵生長調(diào)控因子IGF1的靶向關(guān)系及對(duì)IGF1基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系所用HEK-293T細(xì)胞系由吉林大學(xué)李占軍教授饋贈(zèng)；大鼠肝癌細(xì)胞H4-II-E為本試驗(yàn)室保存細(xì)胞系。

1.2 菌株及載體所用E.coli感受態(tài)細(xì)胞為DH5α，所用載體為psi-CHECKTM-2雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，由吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院歐陽紅生課題組饋贈(zèng)。

1.3 主要試驗(yàn)儀器所用主要試驗(yàn)儀器列表見表1所示。

表1 主要試驗(yàn)儀器

1.4 主要試劑、耗材限制性內(nèi)切酶 NotⅠ(TaKaRa)、XhoⅠ(TaKaRa)，T4DNA 連接酶(TaKaRa)， 酵母提取物(OXOID)，胰蛋白胨(OXOID)，瓊脂粉(OXOID)，NaCl(北京化工)，氨芐青霉素，F(xiàn)uGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑(Promega)，F(xiàn)12K 細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco)，Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(MCE)，0.25% 胰酶(Gibco)，PBS(博士德)，谷氨酰胺(Gibco)，青鏈霉素雙抗(Gibco)， 丙烯酰胺(北京化工)，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(北京化工)，過硫酸銨(北京化工)，鹽酸(北京化工)，TEMED (Biosharp)， 甲醇(北京化工)，蛋白酶抑制劑 Cocktail(MCE)，磷酸酶抑制劑Cocktail (MCE)，無水乙醇(北京化工)，雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(Promega)，凝膠回收試劑盒(天根)，Trizol(TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量試劑盒(TaKaRa)。試驗(yàn)所用離心管、移液吸頭、細(xì)胞培養(yǎng)皿及細(xì)胞培養(yǎng)板等耗材均為Biosharp品牌。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)基配制H4-II-E細(xì)胞及HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)基配制體系，見表2。

表2 H4-II-E細(xì)胞及HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)基配方

1.6 miRNAs合成本試驗(yàn)所研究的miR-709 mimic由蘇州吉瑪生物公司合成，序列見表3，其中包括所用到的mimic的陰性對(duì)照(NC)。

表3 miR-709及NC的核苷酸序列

1.7 靶基因預(yù)測采用在線軟件TargetScan (http://www.targetscan.org) 對(duì)miR-709的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測，采用mfold (http://unafold.rna.albany.edu)對(duì)miR-709與IGF1基因3′UTR互補(bǔ)配對(duì)形成的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.8 載體構(gòu)建為了檢測目標(biāo)miRNA與潛在靶基因的靶關(guān)系，本試驗(yàn)構(gòu)建了豬IGF1基因野生型(WT)、突變型(MUT)及刪除型(DEL)3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。首先合成了IGF1基因的3′UTR序列及對(duì)應(yīng)的miR-709結(jié)合靶點(diǎn)突變及刪除的3′UTR序列，然后將其插入到psiCHECKTM-2的XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)中間形成IGF1-3′UTR-WT、IGF1-3′UTR-MUT和IGF1-3′UTR-DEL重組載體。

載體構(gòu)建過程簡述如下：psiCHECKTM-2載體經(jīng) XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切體系見表4。采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并分別用 T4連接酶與合成的IGF1基因內(nèi)3′UTR片段在16℃條件下過夜連接，連接體系見表5。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，采用菌液 PCR 法和測序法對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.9 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取將轉(zhuǎn)化了IGF1基因3′UTR的重組載體的大腸桿菌于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.10 細(xì)胞轉(zhuǎn)染本試驗(yàn)中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染包括miRNA的轉(zhuǎn)染、miRNA與雙熒光素酶表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染。為了驗(yàn)證目標(biāo)miR-709與IGF1基因的靶關(guān)系，將miRNAs與構(gòu)建好的雙熒光素酶表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，48 h后通過檢測螢火蟲熒光素酶及海參熒光素酶的活性來確定miR-709與IGF1基因的靶關(guān)系；為了檢測miR-709對(duì)IGF1表達(dá)的影響，將miR-709轉(zhuǎn)染至大鼠肝癌細(xì)胞H4-II-E中，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行總RNA及總蛋白質(zhì)的提取。

表4 載體雙酶切體系

表5 目的片段與載體連接體系

1.11 雙熒光素酶活性檢測提前1 d將 4×104cells/well的HEK-293T 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞轉(zhuǎn)染之前使用100 μL新鮮的DMEM培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞1次，并加入 80 μL DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞2 h。psiCHECKTM-2重組質(zhì)粒與miRNAs分別共轉(zhuǎn)染 HEK-293T 細(xì)胞，48 h后按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書分別于多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶活性及海腎螢光素酶的活性。

1.12 總RNA提取本試驗(yàn)采用Trizol法進(jìn)行RNA的提取，即將收集的轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入至500～1 000 μL Trizol中，室溫裂解10 min后，加入0.2倍Trizol體積的氯仿進(jìn)行萃取顛倒混勻，室溫靜置10 min后于4℃離心10 min，取上清加入0.5倍Trizol體積的異丙醇進(jìn)行RNA的沉淀，室溫靜置5 min后于4℃離心10 min，棄上清,用75%的酒精洗滌沉淀，晾干，加入40 μL無RNA酶 ddH2O 進(jìn)行溶解，測定濃度后對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.13 RNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR對(duì)于miR-709，采用特異性頸環(huán)結(jié)構(gòu)引物RT primer(表6 )對(duì)所得總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；對(duì)于mRNA，則采用Oligo dT反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，β-actin和U6分別作為IGF1和miR-709的內(nèi)參基因。

以反轉(zhuǎn)錄得到的的 cDNA 為模板，以miR-709、U6、IGF1及β-actin(表6)為引物，以 SYBR?Green為染料，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。根據(jù) Power SYBR?Green PCR 說明書加反應(yīng)體系：cDNA2 μL，2× Master Mix 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，57℃ 15 s，72℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)，在72℃采集熒光信號(hào)；溶解曲線程序：55℃ 30 s，81個(gè)循環(huán)。

表6 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR引物信息

1.14 總蛋白質(zhì)提取及濃度測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后采用Western及IP裂解液進(jìn)行裂解，將細(xì)胞碎片離心后取上清，采用BCA試劑盒對(duì)所提取的總蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定。

1.15 Western blot檢測在15%濃度SDS-PAGE分離膠上對(duì)總蛋白進(jìn)行分離，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉，然后于4℃進(jìn)行IGF1和β-actin一抗過夜孵育及室溫進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育2 h后在多功能分子成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。

1.16 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)于組間miR-709及IGF1表達(dá)水平差異采用單因素方差(ANOVA)分析，P<0.05為差異顯著(*)，P<0.01為差異極顯著(**)。

2 結(jié)果

2.1 miRNA mimic轉(zhuǎn)染效率及miR-709表達(dá)量檢測為了檢測miRNA在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，我們將FAM標(biāo)記的NC mimic轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，12 h后在熒光顯微鏡下對(duì)其轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，miRNA在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率較高(圖1A)，能夠滿足試驗(yàn)要求。然后為了進(jìn)一步確定miR-709在大鼠肝臟細(xì)胞H4-II-E中的轉(zhuǎn)染效率，本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)染miR-709 mimic及NC mimic 后采用qRT-PCR法對(duì)miR-709的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示miR-709 mimic組細(xì)胞中miR-709的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(圖1B)(P<0.01)。

2.2 miR-709與IGF1基因的靶關(guān)系鑒定基于生物信息學(xué)分析，miR-709的種子序列與IGF1基因3′UTR互補(bǔ)(圖2A)，且結(jié)合形成較穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2B)。IGF1基因3′UTR的雙熒光素酶重組表達(dá)載體(IGF1-3′UTR-WT、IGF1-3′UTR-MUT和IGF1-3′UTR-DEL)與miR-709 或NC轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞后48 h，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒分別對(duì)螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的活性進(jìn)行檢測，相對(duì)熒光素酶活性結(jié)果表明miR-709直接靶向IGF1基因(圖2C)。

2.3 miR-709對(duì)IGF1基因表達(dá)量的影響明確miR-709靶向IGF1基因后，本試驗(yàn)進(jìn)一步將miR-709轉(zhuǎn)染至大鼠肝臟細(xì)胞H4-II-E中，48 h后檢測IGF1表達(dá)量。qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果表明miR-709顯著抑制了IGF1在RNA(圖3A)(P<05)及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(圖3B,C)(P<0.05)。

圖1 miRNA轉(zhuǎn)染效率及miR-709表達(dá)量檢測 A.miRNA在HEK-293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率檢測；B.在H4-II-E細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-709 mimic后miR-709的表達(dá)量檢測

圖2 miR-709靶向IGF1基因 A.miR-709種子序列與IGF1基因3′UTR互補(bǔ)配對(duì)情況；B.miR-709與IGF1基因3′UTR形成的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)；C.miR-709靶向IGF1基因的雙熒光素酶活性檢測結(jié)果

3 討論

在動(dòng)物生長調(diào)控過程中，垂體發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其作用的垂體-IGF1-靶器官生長軸中IGF1是關(guān)鍵的中心環(huán)節(jié)。在血液循環(huán)和局部組織中，絕大部分IGF1由肝臟提供，研究人員證實(shí)過表達(dá)IGF1的小鼠與野生型小鼠相比各器官質(zhì)量顯著增加，并表明IGF1參與到機(jī)體出生至青春期階段的生長，且引起各器官體積成比例地增大[10]。反之，缺乏IGF1則會(huì)導(dǎo)致病人身材相對(duì)矮小[11]，而這種現(xiàn)象可通過長期用IGF1治療明顯恢復(fù)[12]。此外，缺乏IGF1的胎鼠有短肢侏儒癥，礦化延遲，慢性粒細(xì)胞凋亡增加的現(xiàn)象[13]，表明IGF1的促生長作用貫穿出生前及出生后，也足以見得IGF1在動(dòng)物生長中的重要性[14]。

miRNA是一類長度約19～24 nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因的3′UTR部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。研究表明miRNA與動(dòng)物生長密切相關(guān)，表現(xiàn)為在肌肉發(fā)育的各個(gè)環(huán)節(jié)具有重要的調(diào)節(jié)作用，以及涉及骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的遷移、增殖、分化和凋亡，成肌細(xì)胞的分化和肌管融合，肌纖維類型轉(zhuǎn)換等多個(gè)生物學(xué)過程[15]。 目前已經(jīng)在牛、豬、羊等家畜中鑒定到多個(gè)參與骨骼肌發(fā)育的 miRNAs[16-17]。近年來，組織/器官間的信息交流也逐漸成為研究熱點(diǎn)，例如非編碼RNA可能通過外泌體等介質(zhì)進(jìn)行組織間的調(diào)控[18-19]。隨著處于生長軸中心的垂體組織中miRNAs逐漸被挖掘，垂體miRNA的功能也相繼被報(bào)道[20-21]。miRNA 在細(xì)胞之間以及組織之間的表達(dá)具有特異性。有研究證實(shí)miRNA 在某一組織中的特異高表達(dá)往往與該組織的一些典型功能相關(guān)。其中大鼠垂體中miR-7是表達(dá)量最高的miRNA，其可能參與到FSH的表達(dá)調(diào)控，與動(dòng)物繁殖性能相關(guān)[22]。而目前對(duì)于大鼠垂體中第二高表達(dá)的miR-709的功能研究較少，基于ZHANG等[9]的研究結(jié)果可以推斷miR-709可能參與動(dòng)物的生長調(diào)控。因此本試驗(yàn)基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-709可能靶向關(guān)鍵生長因子IGF1基因。

本試驗(yàn)通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及IGF1表達(dá)量檢測證實(shí)了miR-709與IGF1基因的靶向關(guān)系及miR-709對(duì)IGF1表達(dá)的抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明H4-II-E細(xì)胞中表達(dá)較低含量的IGF1，猜測原因可能是此細(xì)胞為大鼠肝癌細(xì)胞，屬于肝臟受損細(xì)胞，因細(xì)胞功能缺失而導(dǎo)致的IGF1表達(dá)量較低。miR-709是在大鼠垂體組織中高表達(dá)的miRNA，IGF1在垂體GH的合成中扮演的是負(fù)反饋調(diào)控因子。因此，推測miR-709在調(diào)控垂體GH-IGF1之間發(fā)揮的可能是平衡的作用，即維持垂體GH表達(dá)的穩(wěn)定性。