陳瑞昶，牛祥云，黃 金，苗永強(qiáng)，胡莉萍，朱瑞良*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院 山東省動物生物技術(shù)與疫病防治重點實驗室，山東 泰安 271018；2.山東省動物疫病預(yù)防與控制中心，山東 濟(jì)南 250022)

肺炎克雷伯菌是一種條件性致病菌，可以導(dǎo)致人和動物腦膜炎、肺炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎、傷口感染甚至敗血癥等[1]，且具有較高的致死率[2]，但在養(yǎng)羊業(yè)中仍未被重視。隨著近年來養(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展，各種抗生素的廣泛使用、甚至濫用，高密度養(yǎng)殖和快速育肥的飼養(yǎng)模式，使該菌對養(yǎng)羊業(yè)的危害也越來越大[3]。

由于肺炎克雷伯菌在羊源方面的研究滯后，尚未見有可以進(jìn)行臨床檢測的方法[4]，而間接免疫熒光檢測法具有操作簡易、靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢。結(jié)合本實驗室研究及近些年的資料報道，采用全菌體免疫家兔制備兔抗羊源肺炎克雷伯菌多克隆抗體，以此為基礎(chǔ)建立了間接免疫熒光標(biāo)記抗體檢測方法[5]，并且通過臨床試驗證明檢測方法穩(wěn)定可靠，具有特異性，能夠應(yīng)用于羊源肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷，同時為羊源肺炎克雷伯菌的快速診斷方法的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[6]。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及血清肺炎克雷伯菌由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室自羊肺中分離、鑒定并保存；大腸桿菌菌株，沙門菌菌株和羊源肺炎克雷伯菌陽性血清由本實驗室保存。

1.2 實驗材料HRP-羊抗兔IgG購自Abcam公司；TMB底物顯色試劑盒購自康為世紀(jì)公司；96孔ELISA酶標(biāo)板購自Costar公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自碧云天公司；比濁管購自康泰生物科技公司；其他化學(xué)試劑為分析純；4只健康非免疫家兔，體質(zhì)量2～3 kg/只，購自山東泰安泰山種兔場；昆明小鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗儀器標(biāo)準(zhǔn)型單人超凈工作臺購自SANYO公司；DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱購自上海慧泰儀器制造有限公司；壓力蒸汽滅菌器購自上海博訊實業(yè)有限公司；BECKMANXL280超速冷凍離心機(jī)；Genes酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；DESATRONIC3000/200，Nichipet EX 系列移液器購自Thermo公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋購自常州國華電器有限公司；QT-2旋渦混合器購自上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；OLYMPUS熒光顯微鏡。

1.4 抗原的制備將肺炎克雷伯菌100 μL，接種于500 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，加入終濃度0.2%甲醛進(jìn)行滅活24 h，8 000 r/min，10 min離心收集沉淀，再用0.1 mol/L，pH7.4的PBS洗滌并制成懸液，通過麥?zhǔn)媳葷岱y定濃度后，4℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.5 多克隆抗體的制備[8]將制備的抗原加白油佐劑制成免疫用抗原，選取非免疫家兔4只，進(jìn)行抗原免疫，采用多點注射的方法進(jìn)行4次免疫，每次間隔7 d，免疫劑量為每次2 mL/只，含菌量為2.3×109CFU/mL，在最后一次免疫后7 d進(jìn)行心臟采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。運用間接ELISA法棋盤滴定檢測多抗效價。

1.6 間接ELISA法檢測多克隆抗體效價間接ELISA法棋盤滴定檢測多抗效價：用碳酸鹽緩沖液包被含菌量為1.0×106CFU/mL 的菌液加入酶標(biāo)板，100 μL/孔，4℃過夜；PBS 作為陰性對照組，加入2% BSA 200 μL/孔，37℃孵育3 h；加入用1% BSA磷酸鹽緩沖液從稀釋度1∶100 開始倍比稀釋的多抗100 μL/孔，37℃ 孵育1 h；加入HRP-羊抗兔IgG 100 μL/孔，37℃孵育1 h；加入底物TMB顯色液100 μL/孔，避光顯色40 min后，加入2 mol/mL H2SO450 μL終止反應(yīng)，迅速在酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的D450值，并計算P/N值。

1.7 實驗動物接種將50只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為A、B 2組，每組25只。A組將培養(yǎng)12 h的肺炎克雷伯菌菌液腹腔注射小鼠，0.2 mL/只，含菌量為2.1×1010CFU/mL；B組作為陰性對照組，腹腔注射等量PBS溶液。36 h內(nèi)死亡小鼠取肺臟，-20℃保存。36 h后A、B組存活小鼠全部處死后取肺臟，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 間接免疫熒光操作程序[9]將待檢組織無菌新鮮切面在載玻片輕壓，獲得樣本，樣本自然干燥。用10%甲醛固定樣本15 min，將樣本完全浸入PBS洗滌3次，每次5 min。將固定好的玻片標(biāo)本置于濕盒中，加入一抗，即稀釋的抗羊肺炎克雷伯菌多克隆抗體于樣本上，于37℃孵育30 min。PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗，即稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，避光，37℃孵育30 min。PBS洗滌3次，每次5 min，加1滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋封片后，熒光顯微鏡下觀察，拍照，記錄熒光強(qiáng)度。

1.9 間接免疫熒光組化法最佳工作條件的優(yōu)化一抗及二抗最佳稀釋度的選擇：同一病料做多張樣本壓片，運用棋盤滴定法篩選最佳稀釋度，一抗為1∶20，1∶40，1∶80，1∶160共4個稀釋濃度；二抗為1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600共4 個稀釋濃度。將篩選出最佳稀釋度的一抗和二抗作為最佳工作條件，進(jìn)行一抗和二抗孵育時間的篩選。一抗孵育時間的篩選：固定好的玻片加入一抗后37℃分別孵育20，30，40 min后加入熒光二抗觀察熒光結(jié)果，篩選一抗的最佳孵育時間。二抗孵育時間的篩選:加入一抗后，加入熒光二抗，37℃分別孵育20，30，40 min后觀察熒光結(jié)果，篩選熒光二抗的最佳孵育時間。

1.10 間接免疫熒光特異性的測定通過上述方法分別將培養(yǎng)的大腸桿菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌和巴氏桿菌菌液涂片，并設(shè)置陽性對照和陰性對照，選用篩選出的最佳工作條件進(jìn)行間接免疫熒光的特異性測定。

1.11 間接免疫熒光重復(fù)性的測定取30份感染肺炎克雷伯菌死亡小鼠的肺臟，各制備玻片3張，保證條件相同下進(jìn)行間接免疫熒光的測定，觀察熒光顯微鏡下熒光強(qiáng)度的差異。

1.12 間接免疫熒光的臨床應(yīng)用對采集自山東各地區(qū)羊場的病料124份進(jìn)行IFA檢測，同時對病料組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)觀察細(xì)菌形態(tài)。并運用16S rRNA測序鑒定分離菌株，對比2種方法的檢驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 制備抗原肺炎克雷伯菌細(xì)菌滅活后離心獲得沉淀，通過麥?zhǔn)媳葷岱y定含菌量為2.3×1010CFU/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 多克隆抗體效價將1，2，3，4號免疫家兔制備出的高免血清進(jìn)行多抗效價的測定，當(dāng)多抗的稀釋倍數(shù)為1∶12 800時P/N=2.582>2.1,稀釋倍數(shù)為 1∶25 600時 P/N=1.504<2.1，因此，通過間接ELISA法棋盤滴定測得多抗抗體效價為1∶12 800(圖1)。

圖1 羊源肺炎克雷伯菌多克隆抗體效價結(jié)果

2.3 一抗工作稀釋度的篩選當(dāng)一抗工作稀釋度為1∶20，1∶40和1∶80時，特異性熒光均很強(qiáng)；一抗工作稀釋度為1∶160時，特異性熒光較弱。為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性又可以節(jié)約抗體的使用量，確定一抗的最佳工作濃度為1∶80(圖2)。

2.4 二抗工作稀釋度的篩選當(dāng)二抗工作稀釋度為1∶200和1∶400時，特異性熒光均很強(qiáng)；一抗工作稀釋度為1∶800和1∶1 600時，特異性熒光較弱。為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，確定二抗的最佳工作稀釋度為1∶400(圖3)。

圖2 不同稀釋度的多克隆抗體對熒光效果的影響 A～D.多抗稀釋度1∶20，1∶40，1∶80,1∶160；E.陰性對照；F.空白對照

圖3 不同稀釋度的熒光抗體對熒光效果的影響 A～D.熒光抗體稀釋度1∶200，1∶400，1∶800,1∶1 600；E.陰性對照；F.空白對照

2.5 一抗孵育時間的篩選當(dāng)一抗孵育20 min時，熒光較弱；孵育30 min時，熒光增強(qiáng)，黃綠色熒光清晰；孵育40 min時，熒光繼續(xù)增強(qiáng)。因此對比后確定一抗最佳孵育時間為30 min(圖4)。

圖4 不同孵育時間的多克隆抗體對熒光效果的影響 A～C.孵育時間分別為20，30，40 min；D.陰性對照

2.6 二抗孵育時間的篩選當(dāng)熒光二抗孵育時間為20 min時熒光強(qiáng)度較弱，孵育時間為30，40 min時熒光強(qiáng)度差異不明顯，因此對比后確定熒光二抗最佳孵育時間為30 min(圖5)。

2.7 間接免疫熒光的特異性和重復(fù)性結(jié)果大腸桿菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌和巴氏桿菌與兔抗羊源肺炎克雷伯菌多克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光試驗，未發(fā)現(xiàn)有特異性的熒光，抗原自發(fā)熒光對照和熒光抗體對照均為陰性，而肺炎克雷伯菌與多抗結(jié)合出現(xiàn)特異性熒光，結(jié)果為陽性，證明檢測方法的特異性較高(圖6)。同時對30份感染肺炎克雷伯菌死亡小鼠的肺臟進(jìn)行的重復(fù)性試驗結(jié)果表明均為陽性，特異性熒光強(qiáng)度差異不明顯，表明重復(fù)性良好。

圖5 不同孵育時間的熒光抗體對熒光效果的影響 A～C.孵育時間分別為20，30，40 min；D.陰性對照

圖6 不同抗原和多抗作用的特異性熒光比較 A.大腸桿菌；B.沙門菌；C.枯草芽孢桿菌；D.巴氏桿菌；E.肺炎克雷伯菌；D.陰性對照

2.8 間接免疫熒光的臨床應(yīng)用通過兔抗羊肺炎克雷伯菌多克隆抗體對124份臨床病料進(jìn)行間接免疫熒光檢測，同細(xì)菌分離鑒定結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果表明符合率為98.4%(表1)。

表1 間接免疫熒光法與細(xì)菌分離鑒定法 對臨床樣品檢測結(jié)果的比對

3 討論

在我國的畜牧生產(chǎn)中，養(yǎng)羊業(yè)逐漸向集約化、規(guī)模化的方向發(fā)展，嚴(yán)格控制養(yǎng)羊場各種疫病的發(fā)生對養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要[4]?？死撞鳛橐环N條件性的人獸共患病病原，當(dāng)符合發(fā)病條件時，會對人和動物造成嚴(yán)重的影響，而肺炎克雷伯菌主要引起羊的肺部炎癥、腦部出血，最終導(dǎo)致病羊死亡。因此，對于羊源肺炎克雷伯菌需要建立有效的預(yù)防措施，為養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展起到有效的保護(hù)作用。

肺炎克雷伯菌在國內(nèi)僅有少數(shù)檢測方法，針對羊源肺炎克雷伯菌的檢測并沒有相應(yīng)研究。間接免疫熒光是利用特異性抗體先和樣品中相應(yīng)抗原進(jìn)行結(jié)合，再加入用熒光素標(biāo)記的抗抗體同抗原-抗體復(fù)合物中的一抗進(jìn)行結(jié)合，經(jīng)過處理后，未知抗原或抗體在熒光顯微鏡下出現(xiàn)特異性熒光的檢測方法[10]。與16S rRNA檢測方法及李富祥等[11]建立的熒光定量PCR檢測方法相比，這種方法在檢測過程中不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，實驗過程簡易，結(jié)果的判定明顯，是建立快速診斷方法的首選[12]。

本試驗是將羊肺分離并鑒定后的肺炎克雷伯菌的菌體，滅活制成免疫抗原，經(jīng)4次免疫健康家兔，制備兔抗羊肺炎克雷伯菌多克隆抗體[13]。通過間接ELISA法，進(jìn)行棋盤滴定測定制備的多克隆抗體的效價為1∶12 800[14]。

利用兔抗羊源肺炎克雷伯菌多克隆抗體建立的間接免疫熒光檢測方法，多克隆抗體的稀釋度為1∶80；FITC標(biāo)記抗體的稀釋度為1∶400，一抗孵育時間為30 min，熒光二抗孵育時間為30 min，在篩選后的工作條件下，陽性樣本出現(xiàn)了大量的黃綠色特異性熒光，沒有非特異性熒光產(chǎn)生。在異源抗原的檢測中，兔抗羊源肺炎克雷伯菌多克隆抗體同大腸桿菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌和巴氏桿菌菌體進(jìn)行間接免疫熒光方法檢測后結(jié)果為陰性，同肺炎克雷伯菌進(jìn)行間接免疫熒光方法檢測后結(jié)果為陽性，證明建立的間接免疫熒光具有較強(qiáng)的特異性。為進(jìn)一步驗證建立的檢測方法在臨床中的實際效果，本試驗對124份山東省內(nèi)不同羊場的羊病料進(jìn)行了間接免疫熒光檢測和細(xì)菌的分離鑒定對比[15]，2種方法的符合率為98.4%。在臨床的檢測中間接免疫熒光的測定準(zhǔn)確性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡易，耗時少，在羊源肺炎克雷伯菌抗原的快速診斷中具有良好的應(yīng)用前景[16]。

本試驗成功建立了羊源肺炎克雷伯菌的間接免疫熒光檢測方法，經(jīng)過臨床試驗后證明該檢測方法的特異性強(qiáng)，靈敏度高，可以滿足生產(chǎn)中的檢測要求，為羊肺炎克雷伯菌流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷和快速診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。