趙晨婕，潘明，*，劉念，王超凱，3，4，常少健，3，4，張翼，3，4，劉義會，3，4，郭杰，3，4，蔡海燕，3，4，李覓，3，4，余航，3，4，孫中理，3，4，李斌

（1.四川輕化工大學(xué)，四川自貢643000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川成都611130；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點試驗室，四川成都611130；4.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000；5.瀘州和榮酒業(yè)有限公司，四川瀘州646000）

己酸乙酯是濃香型白酒的主要香味物質(zhì)[1-3]，其具有菠蘿以及香蕉樣香氣，且香氣閾值很低[4-6]。在濃香型白酒特定的釀造環(huán)境下，己酸乙酯主要是在窖池內(nèi)由己酸菌產(chǎn)生的己酸和酵母菌產(chǎn)生的乙醇通過微生物的酯化作用合成的[7-10]。在己酸菌培養(yǎng)液中，己酸等有機酸的組成及其含量往往隨菌種的種類、純度和發(fā)酵工藝的變化而變化[11-12]，分析其中的有機酸組成與含量對開發(fā)己酸菌菌種資源、完善己酸菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件和科學(xué)地指導(dǎo)白酒生產(chǎn)都具有極其重要的意義。因此，在己酸菌的篩選、培養(yǎng)過程中如何快速、準(zhǔn)確測定發(fā)酵液中的己酸等有機酸的含量是非常值得研究的[13-17]。

目前測定己酸菌發(fā)酵液中己酸的方法主要有：比色法和氣相色譜法。比色法主要原理是，硫酸銅與發(fā)酵液中的己酸反應(yīng)呈藍(lán)色，己酸含量越高藍(lán)色越深，通過測定溶液OD 值算出己酸含量[18]。該法雖然操作簡便，但是試驗過程中萃取劑為乙醚，對環(huán)境和人體的傷害較大[19]；氣相色譜法對白酒中的有機酸含量檢測較為準(zhǔn)確，但是發(fā)酵液中的己酸存在于水相中，提取己酸的方法影響到檢測的準(zhǔn)確性[20]。發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后，在毛細(xì)管色譜柱上直接進(jìn)樣檢測[21]，由于己酸沸點較高，直接蒸餾提取效率低，造成的誤差較大，經(jīng)乙醇溶解，甲酯化處理后再蒸餾，餾出液直接進(jìn)氣相色譜檢測，雖然結(jié)果較準(zhǔn)確，但甲酯化的過程時間較長，操作復(fù)雜[22]。本研究主要考察利用有機溶劑液液萃取-氣相色譜法快速定量測定己酸菌發(fā)酵液中己酸含量方法的穩(wěn)定性，為進(jìn)一步的試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

己酸菌發(fā)酵液：食品發(fā)酵實驗室自備；氯化鈉（分析純）、乙酸乙酯（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）、正己烷（色譜純）、己酸（色譜純）、2－乙基正丁酸（色譜純）、乙醇（色譜純）：西隴化工廠；0.45 μm 微孔濾膜：津騰試驗設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6820 氣相色譜儀配氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）、P/N5190-1483 進(jìn)樣針、白酒分析專用色譜柱（型號FFAP）：美國Agilent 公司；ALC-110.4 電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 內(nèi)標(biāo)物溶液制備

精密量取2-乙基正丁酸2 mL 至100 mL 容量瓶，使用60%的色譜級純乙醇定容，混勻，制得0.368 g/L的內(nèi)標(biāo)物溶液，備用。

1.3.2 樣品預(yù)處理方法

量取適量樣品，調(diào)節(jié)溶液pH 值，用移液管移取5 mL 玻璃試管中，加入2 g 氯化鈉，振蕩混勻。用大肚移液管精確移取10 mL 萃取劑加入玻璃試管中。上下?lián)u晃10 次～15 次，放于試管架靜置30 min 后。吸取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾至5 mL 容量瓶中，定容，加標(biāo)100 μL，待上機測定。

1.3.3 氣相色譜分析條件

色譜柱：白酒分析專用色譜柱（型號FFAP）（50 m×0.25 mm×0.5 μm）。

程序升溫：初始溫度47 ℃，保持5 min，以4.5 ℃/min的速率升溫至70 ℃，再以5 ℃/min 的速率升溫到98 ℃，維持 1 min，以 5 ℃/min 的速率升溫至 145 ℃，以5 ℃/min 的速率升溫至 190 ℃，以 10 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，保持15 min；汽化室溫度250 ℃；檢測器溫度 250 ℃，載氣為高純氮氣（N2），柱流速：3 mL/min；分流比為 1 ∶1；進(jìn)樣量：0.6 μL；進(jìn)樣模式：分流；進(jìn)樣方式：手動進(jìn)樣；數(shù)據(jù)分析：Agilent Cerity QA-AC 工作站軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 己酸保留時間的確定

將己酸對照品處理后加內(nèi)標(biāo)100 μL，上機測定。色譜圖見圖1。

由圖1 可知，內(nèi)標(biāo)物和對照品均獨立出峰，2-乙基正丁酸和己酸保留時間分別為27.219 min 和28.962 min。

2.2 萃取劑選擇

分別以乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷作萃取劑，萃取同一發(fā)酵液中的己酸。按照1.3.2 節(jié)方法提取制備供試液，并按1.3.3 節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析，記錄己酸峰面積。每種萃取劑做3 個重復(fù)試驗，結(jié)果見圖2。

相同濃度己酸溶液分別用相同體積乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷萃取，色譜峰面積可反映出不同萃取劑的萃取效果，峰面積越大說明該溶劑對己酸的萃取效果越好。由圖2 可知，3 種萃取劑萃取效果差異顯著（P＜0.05）。其中，乙酸乙酯的萃取效果最好，己酸平均峰面積為117.78，二氯甲烷的萃取效果次之，己酸平均峰面積為107.18，正己烷萃取效果最差，己酸平均峰面積為88.44。綜上所述，選取乙酸乙酯為萃取劑進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 發(fā)酵液pH值調(diào)節(jié)

圖1 己酸出峰時間Fig.1 Peak time of caproic acid

圖2 萃取劑萃取己酸效果Fig.2 Effect of extractant on caproic acid extraction

圖3 對己酸測定影響Fig.3 Effect of pH value on determination of caproic acid

由于己酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的己酸會與發(fā)酵液中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，以鹽的形式存在于水相中，有機溶劑無法萃取，因此需調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH 值，利用強酸制弱酸的原理將己酸置換出來。以試驗室常用的硫酸和鹽酸作為備選pH 值調(diào)節(jié)劑。通過試驗發(fā)現(xiàn)，硫酸與萃取劑乙酸乙酯不互溶，鹽酸與萃取劑乙酸乙酯互溶。因此采用硫酸調(diào)節(jié)溶液pH 值不會對色譜柱造成損害。以1.5 mol/L 的硫酸將溶液 pH 值分別調(diào)整為 5、4、3、2、1，測定己酸含量的變化。每個試驗重復(fù)做3 個，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，發(fā)酵液pH 值從5 降低至2 的過程中，己酸含量從55.5 mg/100 mL 升至286.8 mg/100 mL，顯著升高。當(dāng)pH 值達(dá)到2 時，再繼續(xù)降低pH 值到1，己酸變化不顯著。說明pH 值為2 時，發(fā)酵液中己酸從鹽的形式完全被置成酸。因此需要將發(fā)酵液pH 值調(diào)節(jié)至2，才能使己酸以游離態(tài)存在，保證后續(xù)檢測準(zhǔn)確。

2.4 精密度試驗

精密度試驗考察濃度為55.0 mg/100 mL 的己酸溶液，用乙酸乙酯作萃取劑，按照1.3.2 節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，進(jìn)行氣相色譜法分析，分別平行測6 次，結(jié)果見表1。

表1 己酸精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 1 Precision tests results of caproic acid

由表1 可知，已知濃度為55.0 mg/100 mL 的己酸溶液6 次測定結(jié)果在55.0 mg/100 mL～60.6 mg/100 mL之間，平均值為57.3 mg/100 mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=3.46%，結(jié)果表明該方法精密度高。

2.5 加標(biāo)回收率試驗

向濃度為129.6 mg/100 mL 的己酸菌發(fā)酵液中分別加入 50.0、100.0、150 mg/100 mL 的己酸標(biāo)品，混勻。以乙酸乙酯作萃取劑按照1.3.2 節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，進(jìn)行氣相色譜法分析，每個濃度做3 個平行試驗，結(jié)果見表2。

由表2 可知，向濃度為129.6 mg/100mL 的發(fā)酵液中添加3 個濃度的己酸標(biāo)品，回收率在98.19%～104.43%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 在2.19%～3.51%之間，己酸菌發(fā)酵液的pH 值低，且成分復(fù)雜，干擾因素多，該方法的回收率在80%～120%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 小于5%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 己酸加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 2 Adding standard recovery rate tests results of caproic acid

3 結(jié)論

在相同的己酸標(biāo)準(zhǔn)物添加量以及相同的氣相色譜條件下，使用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷3 種不同的有機試劑作為萃取劑，萃取效果差異顯著。其中，乙酸乙酯的萃取效果最好，檢出己酸平均峰面積為117.78。pH 值為2 時，發(fā)酵液中己酸從鹽的形式完全被置成酸，此時己酸檢出含量最為準(zhǔn)確。本試驗測定己酸的平均回收率在98.19%～104.43%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 在2.19%～3.51%之間，表明該方法準(zhǔn)確度良好。