蔣耀瑛，霍湘蕓，董子鈺，范曉越，黃志偉，王歲樓

（中國藥科大學工學院，江蘇南京 211198）

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石楠葉，新鮮紅葉石楠綠葉片，2018年4月采摘于中國藥科大學江寧校區(qū)食堂門口。選擇顏色明艷、大小均勻、形狀完整的葉片，洗凈瀝干水分后，于烘箱內40℃下烘干，恒質量后真空干燥1 h，然后粉碎、過100目篩，避光保存。

主要試劑：丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、無水乙醇、β-胡蘿卜素、氧化鋁、硅藻土等，均為分析純試劑；柱層析硅膠，100～200目。

主要儀器：DFY-500型高速中藥粉碎機、DZF-6050型真空干燥箱、TU-1810型紫外-可見分光光度計、HH-8型數顯恒溫水浴鍋、TGL-16G型高速臺式離心機等。

1.2 類胡蘿卜素的提取

準確稱取1 g紅葉石楠綠葉粉末，以一定料液比加入提取溶劑，在一定溫度下提取一定時間，離心得上層清液即為粗提液。

（1）料液比的影響。丙酮為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，溫度40℃，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30條件下暗處水浴密封提取2 h。于波長450 nm處測定吸光度。

（2）提取時間的影響。以丙酮為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，提取溫度40℃，料液比1∶20，暗處水浴密封提取1.0，1.5，2.0，2.5 h。于波長450 nm處測定吸光度。

（3） 提取溶劑的影響。選用無水乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮∶石油醚（1∶2），丙酮∶石油醚（3∶7），丙酮∶乙醇（1∶1） 為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，料液比1∶20，溫度40℃，暗處水浴密封提取2 h。于波長450 nm處測定吸光度。

（4）提取溫度的影響。丙酮為溶劑，分別稱取1.0 g粉末于試管中，料液比1∶20，分別在溫度30，35，40，45，50℃下暗處水浴密封提取2 h。于波長450 nm處測定吸光度。

C.He thinks it’s a good way to travel.D.He may make some friends his age.

（5）正交試驗。紅葉石楠葉類胡蘿卜素分離的正交試驗采用四因素三水平L9（34）的設計方法。

提取正交試驗的因素與水平設計見表1。

表1 提取正交試驗的因素與水平設計

1.3 類胡蘿卜素的分離純化

選用一定的吸附劑和洗脫劑濕法裝柱，加入1 mL類胡蘿卜素粗提液，用一定洗脫劑進行洗脫，收集色素液，于波長450 nm處測定吸光度。

（1） 吸附劑的選擇。分別稱取15 g硅膠、硅藻土、氧化鋁、硅膠∶硅藻土=1∶1吸附劑，濕法裝柱，加入1 mL類胡蘿卜素粗提液，用洗脫劑（石油醚∶丙酮=2∶1） 進行洗脫，收集色素液，于波長450 nm處測定吸光度。

（2）吸附劑質量的選擇。分別稱取10.0，15.0，17.5，20.0，25.0 g的硅膠，用洗脫劑（石油醚∶丙酮=2∶1） 濕法裝柱，進行洗脫，收集色素液，于波長450 nm處測定吸光度。

（3） 洗脫劑的選擇。稱取5份15 g硅膠，分別用洗脫劑（石油醚∶丙酮=4∶1，10∶3，7∶3，2∶1，5∶3）濕法裝柱，加入1 mL類胡蘿卜素粗提液，洗脫，收集色素液，于波長450 nm處測定吸光度。

1.4 類胡蘿卜素含量的測定

于波長450 nm下測粗提液的吸光度，根據β-胡蘿卜素標準品繪制的標準曲線計算類胡蘿卜素含量。Y=0.073 6X+0.002 7，Y為吸光度，X為質量濃度（μg/mL）。

1.5 類胡蘿卜素的定性分析

采用1.3中最佳純化條件下的分離色素液，用純丙酮作對照，于波長300～700 nm處進行紫外光譜掃描分析。

2 結果與分析

2.1 紅葉石楠類胡蘿卜素的提取

料液比對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖1，提取時間對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖2，提取溶劑對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖3，提取溫度對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖4。

從圖1可知，在料液比1∶10時，類胡蘿卜素總含量最高，提取效果最好。由圖2可知，隨著提取時間增加，類胡蘿卜素含量提高，超過2 h后，類胡蘿卜素含量逐漸減少。由圖3可知，最佳提取溶劑為丙酮，此時類胡蘿卜素含量達最大值，類胡蘿卜素提取效果最佳。由圖4可知，提取溫度在40℃時，類胡蘿卜素總含量最高，提取效果最好。

L9（34）提取正交試驗結果見表2。

表2 L9（34）提取正交試驗結果

由表2可知，各因素影響大小依次為料液比＞提取溫度＞提取時間＞提取溶劑，最優(yōu)理論條件組合是A1B3C2D2，通過試驗驗證，此結果提取效果最佳，類胡蘿卜素含量平均值為51.40 μg/g，但跟表2中最高提取組合A1B2C2D2中類胡蘿卜素含量51.26 μg/g差距不大，考慮到經濟效益，因此選擇在40℃下以丙酮∶乙醇=1∶1為提取劑，料液比1∶10，浸提時間1.5 h為最佳提取方案。

2.2 紅葉石楠類胡蘿卜素的分離純化

吸附劑種類對類胡蘿卜素含量的影響見圖5，吸附劑質量對類胡蘿卜素含量的影響見圖6，洗脫劑種類對類胡蘿卜素含量的影響見圖7。

由圖5可知，當吸附劑為硅膠時，類胡蘿卜素含量達到最大值，分離純化效果最佳。由圖6可知，吸附劑硅膠質量為20 g時，分離純化效果最好。由圖7可知，當洗脫劑為石油醚∶丙酮=10∶3時，分離純化效果最好。

由于硅膠外的其他吸附劑分離純化效果不佳，因此不再進行正交試驗獲取最佳純化方案，由吸附劑質量及洗脫劑種類試驗，純化倍數最高的方案是20 g硅膠作為吸附劑，石油醚∶丙酮=2∶1作為洗脫劑，測得樣品類胡蘿卜素質量濃度為7.22 μg/mL。此時純化倍數=7.22/5.13=1.41，式中5.13和7.22分別為純化前后樣品中類胡蘿卜素的質量濃度。

2.3 紅葉石楠類胡蘿卜素紫外吸收光譜圖

分離的類胡蘿卜素吸收光譜圖見圖8，β-胡蘿卜素吸收光譜圖見圖9。

由圖8可知，紅葉石楠綠葉中分離的類胡蘿卜素具有類胡蘿卜素的3個吸收峰的光譜特征，與圖9進行對比，更能看出分離色素的最大吸收波長和精細結構與β-胡蘿卜素較吻合[5]。

3 結論

從紅葉石楠綠葉中提取類胡蘿卜素的最佳工藝條件為在40℃下以丙酮∶乙醇=1∶1為提取劑，料液比1∶10，浸提時間1.5 h，其類胡蘿卜素提取率平均值可達51.26 μg/g，具有一定的可行性和應用前景，值得進一步探索研究。