安 靜 張 睿 劉曉樂

(河南省省立醫(yī)院麻醉科，鄭州 450000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，多數(shù)是由于機(jī)體處于創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染、中毒、休克或吸入毒性氣體等產(chǎn)生的急性的、進(jìn)行性的低氧性呼吸功能衰竭，后期會(huì)引發(fā)多臟器功能障礙，甚至導(dǎo)致死亡。有報(bào)道稱，ALI死亡率高達(dá)40%以上[1]。脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷死亡率較高，而Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)家族中的TLRs4是脂多糖的受體，它與先天性免疫系統(tǒng)關(guān)系密切。miR-146a隸屬于miR-146家族，在天然免疫過程中發(fā)揮著負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用，能夠調(diào)節(jié)多種炎性因子的表達(dá)，從而達(dá)到控制炎癥的目的[2]。依托咪酯作為一種咪唑類衍生的非巴比妥類短效全身麻醉藥，是臨床上常用的麻醉性藥物，它對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能有一定的抑制作用，而腎上腺皮質(zhì)對(duì)機(jī)體的炎性反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用，依托咪酯通過對(duì)基因水平的調(diào)控，可以增強(qiáng)體內(nèi)抗炎因子的基因轉(zhuǎn)錄和合成，抑制致炎因子的基因轉(zhuǎn)錄和合成，從而能有效降低手術(shù)患者體內(nèi)的炎性因子水平。但是依托咪酯在麻醉過程中對(duì)患者體內(nèi)炎性因子的影響機(jī)理尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過研究依托咪酯干預(yù)導(dǎo)致體內(nèi)高表達(dá)miR-146a，從而調(diào)節(jié)TLR4通路達(dá)到控制內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠炎癥反應(yīng)的作用，并為ALI臨床預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 LPS購自美國(guó)Sigma公司；依托咪酯(20 mg/10 ml國(guó)藥準(zhǔn)字：H32022992)購自江蘇恩華；TNF-α、IL-6和 IL-1β檢測(cè)試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司；超凈工作臺(tái)購自天津醫(yī)藥凈化設(shè)備廠；梯度PCR儀購自德國(guó)Biometre公司；DU800核酸蛋白分析儀購自德國(guó)BECKMAN COULTER公司；BALB/c 小鼠 80只，雄性，12周，體重(20±2)g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk (粵)2008-0002；所有操作均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。蛋白提取試劑購自北京索萊寶科技有限公司；一抗購自美國(guó)Abcam公司；Trizol Reagent購自大連TaKaRa生物技術(shù)公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自昆明倍捷科技有限公司；SYRB Real-time PCR 試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；辣根標(biāo)記羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠TLR4抗體購自美國(guó)Santa公司；DNA及蛋白maker、引物購自大連寶生物公司；Western blot檢測(cè)設(shè)備購自北京新諾立華儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作與分組 SPF級(jí)別BALB/c雄性小鼠60只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、依托咪酯組，每組20只。參照文獻(xiàn)[3]對(duì)所有小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。模型組及藥物干預(yù)組給予腹腔注射LPS，濃度2 mg/ml，約200 μl/只 (20 mg/kg)。空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水腹腔注射。注射LPS后，小鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快，活動(dòng)力降低，拒絕飲水，寒戰(zhàn)，無力逃避，毛發(fā)聳立，解稀水樣便。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥方式 藥物干預(yù)組于造模后0.5 h給予依托咪酯，依托咪酯劑量則根據(jù)人、小鼠等效劑量換算，換算后給藥劑量為2.5 mg/kg?？瞻讓?duì)照組及模型組給予等體積生理200 μl/只。

1.2.3標(biāo)本采集及檢測(cè)方法

1.2.3.1內(nèi)毒素含量檢測(cè) 于給藥后6 h采用摘除眼球取血法，收集約0.5 ml血液，離心后留取富含血小板的血漿，應(yīng)用動(dòng)態(tài)濁度法-血漿內(nèi)毒素檢測(cè)試劑，將血漿加入到內(nèi)毒素檢品處理液中，應(yīng)用LPS檢測(cè)分析得出數(shù)據(jù)。

1.2.3.2RT-PCR檢測(cè)miR-146a、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺組織中的表達(dá) 根據(jù)Trizol法提取總RNA，將抽取的RNA取500 ng經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以 cDNA產(chǎn)物為模板，用Real-time PCR法檢測(cè) miR-146a，MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)。MyD88引物：上游：5′-GGACTGCCAGAAATACATACGC-3′；下游：5′-CTTTGTCTGTGGGACACTGCTC-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度為94 bp，退火溫度為52℃。IRAK1引物：上游：5′-GCTCCCAGACCCATTCTGAG-3′；下游：5′-CTCTGGGCTTGGCTT-GATGG-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度為96 bp，退火溫度為60℃。IRF5引物：上游：5′-ATGATTACGTTCTGGGAG-AAGA-3′；下游：5′-TCTTTGGGTAAGGAATAGGGTG-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度為205 bp，退火溫度為52℃。TRAF6引物：上游：5′-AAGTTGCCGAGATGGAAGC-3′；下游：5′-CCAGGGCTATGAATGACCAC-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度為118 bp，退火溫度為59℃。Real-time PCR 擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 45 s，共 40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以miR-39、U6和GAPDH作為內(nèi)參照。

1.2.3.3Western blot檢測(cè)TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRF5蛋白在肺組織中的表達(dá) 取實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織經(jīng)處理后離心提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白分子量大小選取8%或10%的分離膠進(jìn)行分離，取30 μg樣本上樣，進(jìn)行彩染蛋白分子量指示SDS-聚丙烯酰胺凝膠，大小10 cm×10 cm，經(jīng)80 V恒壓分離30 min后調(diào)至120 V恒壓，當(dāng)?shù)鞍字甘緞┮苿?dòng)至分離膠底部時(shí)再用300 mA恒流電旋轉(zhuǎn)75 min，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。兔抗小鼠TLR4抗體、兔抗小鼠MyD88抗體、兔抗小鼠TRAF6抗體、兔抗小鼠IRAK1抗體、兔抗小鼠IRF5抗體4℃分離過夜，TBST洗滌3次，二抗孵育1 h后ECL顯色，曝光拍照，Tannon Gis軟件分析曝光底片光密度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況 各組小鼠無中途脫落?？瞻讓?duì)照組小鼠活動(dòng)及進(jìn)食及外界刺激反應(yīng)正常。模型組及依托咪酯組小鼠在應(yīng)用LPS后，出現(xiàn)呼吸頻率加快、活動(dòng)力下降，進(jìn)食減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)差等，但兩組比較，模型組癥狀明顯較重，出現(xiàn)呼吸窘迫、寒戰(zhàn)、拒絕食水。

2.2小鼠血清內(nèi)毒素(ET)含量 空白對(duì)照組小鼠血清內(nèi)毒素含量非常低，但模型組、依托咪酯組與空白對(duì)照組，血清內(nèi)毒素含量明顯升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模成功，存在內(nèi)毒素?fù)p傷。依托咪酯組與模型組比較，依托咪酯組小鼠血清內(nèi)毒素含量下降，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明依托咪酯具有減輕內(nèi)毒素?fù)p傷的作用。具體見圖1。

2.3BALF中TNF-α、IL-6 和 IL-1β的含量 空白對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6 和IL-1β含量非常低，但模型組、依托咪酯組與空白對(duì)照組，TNF-α、IL-6和 IL-1β含量明顯升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明LPS誘導(dǎo)小鼠肺臟產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多。與模型組比較，依托咪酯組TNF-α、IL-6和IL-1β含量下降，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明依托咪酯具有減輕急性肺損傷炎癥反應(yīng)，降低炎性細(xì)胞因子作用。具體見圖2。

2.4miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺組織中的表達(dá) 空白對(duì)照組小鼠肺組織可以檢測(cè)到一定水平的miR-146a表達(dá)。模型組、依托咪酯組小鼠肺組織中miR-146a表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，依托咪酯組miR-146a表達(dá)水平更高，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻讓?duì)照組小鼠肺組織中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)，但模型組、依托咪酯組與空白對(duì)照組比較，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，依托咪酯組TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見圖3。

圖1 小鼠血清內(nèi)毒素含量(ELISA)Fig.1 ET concentration in blood serum(ELISA)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

圖2 肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量(ELISA)Fig.2 TNF-α,IL-6 and IL-1β concentration in bronchoalveolar lavage fluid(ELISA)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

圖3 肺組織中miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA的表達(dá)(RT-PCR)Fig.3 miR-146a,TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 relative expression in lung tissue of mice(versus LPS)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 verus LPS.

圖4 肺組織中TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白的表達(dá)(WB)Fig.4 TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 protein expression in lung tissue of mice(WB)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

圖5 肺組織中TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白的表達(dá)(WB)Fig.5 TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 protein expression in lung tissue of mice(WB)

2.5TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRF5蛋白在肺組織中的表達(dá) 空白對(duì)照組小鼠肺組織中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白表達(dá)，但模型組、依托咪酯組與空白對(duì)照組比較，表達(dá)水平明顯上調(diào)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，依托咪酯組表達(dá)水平下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見圖4、5。

3 討論

TLRs是人體先天免疫的重要組成部分，調(diào)控其表達(dá)可以促進(jìn)附近臟器的炎癥修復(fù)。TLR4作為TLRs家族中發(fā)現(xiàn)最早的受體之一，可以識(shí)別細(xì)菌中LPS，在內(nèi)毒素耐受中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)正常細(xì)胞受到感染刺激時(shí)釋放的LPS和CD14相結(jié)合，然后與TLR4聚合后活化使得信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，活化后的TLR4與MyD88結(jié)合并活化，活化后的MyD88與IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)相結(jié)合，從而導(dǎo)致IRAK磷酸化，進(jìn)而激發(fā)TNF受體相關(guān)因子-6(TRAF-6)釋放，最終導(dǎo)致相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而導(dǎo)致炎性因子釋放。如果能夠影響細(xì)胞內(nèi)外的TLR4水平來阻斷TLR4傳遞LPS信號(hào)通路，可以有效抑制內(nèi)毒素產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。miR-146是在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控作用microRNA，分為miR-146a和miR-146b兩種，分別位于人類基因的第五號(hào)和第十號(hào)染色體上，在小鼠基因中位于第十一號(hào)和第十九號(hào)染色體上[4]。miR-146a和miR-146b僅有兩個(gè)核酸序列不同，近年來對(duì)miR-146a研究較多，發(fā)現(xiàn)miR-146a與NF-κB通路相連，廣泛參與了腫瘤、炎癥等生命活動(dòng)[5-7]。miR-146a作為一種炎癥保護(hù)性因子可以在多個(gè)水平上調(diào)控TLR4信號(hào)通路，主要表現(xiàn)在：①miR-146a可以調(diào)控TLR4的表達(dá)；②miR-146a可以作用于TLR4中的信號(hào)通路分子，如IRAK1、IRF5、TRAF6，抑制其釋放；③miR-146a作用于TLR信號(hào)通路調(diào)節(jié)基因，通過多條途徑調(diào)控TLR4通路，從而抑制TLR4的促炎癥通路[8-10]。

本研究中，通過LPS誘導(dǎo)建立急性肺損傷小鼠模型，并給予依托咪酯進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)依托咪酯組與模型組比較，依托咪酯組小鼠血清內(nèi)毒素含量明顯下降，表明依托咪酯具有減輕內(nèi)毒素?fù)p傷的作用。通過對(duì)BALF中TNF-α、IL-6和 IL-1β的含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)模型組、依托咪酯組與空白對(duì)照組，TNF-α、IL-6和 IL-1β含量明顯升高，說明LPS誘導(dǎo)小鼠肺臟產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多。與模型組比較，依托咪酯組TNF-α、IL-6和IL-1β含量下降，表明依托咪酯具有減輕急性肺損傷炎癥反應(yīng)，降低炎性細(xì)胞因子作用。通過檢測(cè)miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠肺組織可以檢測(cè)到一定水平的miR-146a表達(dá)；模型組、依托咪酯組小鼠肺組織中miR-146a表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高，與模型組比較，依托咪酯組miR-146a表達(dá)水平更高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組小鼠肺組織中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)，但模型組、依托咪酯組與空白對(duì)照組比較，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，與模型組比較，依托咪酯組TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)水平下降。模型組、依托咪酯組與空白對(duì)照組比較TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，與模型組比較，依托咪酯組TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6表達(dá)水平明顯下降。綜上研究發(fā)現(xiàn)，模型組炎癥因子及TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA水平明顯上調(diào)，提示ALI的發(fā)生于炎癥因子及TLR4有關(guān)。和模型組相比，依托咪酯組可以明顯提高miR-146a含量，同時(shí)依托咪酯組的炎癥因子水平較模型組明顯下降，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表達(dá)水平較模型組明顯下降，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6表達(dá)水平較模型組明顯下降，說明依托咪酯能夠通過提高miR-146a含量進(jìn)而調(diào)節(jié)TLR4通路，抑制TLR4表達(dá)水平，對(duì)LPS誘導(dǎo)的MyD88、TRAF6等mRNA及蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用。

本研究表明，依托咪酯可以提高炎癥保護(hù)性因子miR-146a的含量，進(jìn)而調(diào)節(jié)TLR4通路對(duì)內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。但該研究結(jié)果有待更大樣本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。