朱麗麗 張曉霞 王 振 薛 靜 汪 婷 王 浩

(寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，銀川 750004)

糖尿病是公認的重大健康問題[1]，全球患病人數(shù)超過4.5億[2]，嚴重威脅人類身體健康。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種由遺傳和環(huán)境多種因素共同引起的以胰島素抵抗為主、同時伴有胰島 β 細胞功能受損的內分泌疾病[3]。臨床研究顯示[4]，炎癥因子如IL-6、IL-1β和TNF-α可激活一系列信號通路，誘發(fā)低度炎癥反應，干擾正常胰島素信號傳導，引起胰島素抵抗。其中炎癥因子介導的慢性免疫炎癥反應在T2DM發(fā)病機制中起著至關重要的作用[5]。

髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是骨髓祖細胞和未成熟髓細胞組成的異質細胞群，是樹突狀細胞、粒細胞和巨噬細胞的前體。MDSCs在罹患癌癥、炎癥和感染期間增殖明顯[6-8]，顯著抑制T細胞反應[9-11]。目前，對MDSCs不僅局限于腫瘤的研究，在慢性炎癥、病毒感染和自身免疫性疾病中的研究也日益增多[12]。

除臨床干預外，膳食添加劑有望成為預防和緩解糖尿病的重要手段。而亞麻籽油(flxseed oil,FO)是目前ω-3 多不飽和脂肪酸含量最高的植物油脂之一[13]，含有豐富的亞麻酸(α-linolenic acid,ALA)，具有包括抗炎在內的多種生物學功能的優(yōu)質食用油[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)O可以通過降低小鼠血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及調節(jié)腸道菌群來改善酒精性肝病[15]。然而，F(xiàn)O對T2DM大鼠MDSCs及血漿炎癥因子的影響尚不清楚。在該實驗中為確保攝入能量一致，采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和煙酰胺(nicotina-mide，NA)依次腹腔注射成功誘導T2DM模型[16]，并用流式細胞術檢測外周血和脾臟中MDSCs比例變化，用ELISA測定血漿中炎癥因子表達，用Pearson方法分析MDSCs和炎癥因子的相關性，初步探索FO對T2DM的作用，為FO抗炎和實際開發(fā)應用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 180～200 g雄性SD大鼠32只，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(寧)2015-0001。FO購自寧夏六盤珍坊生態(tài)農業(yè)科技有限公司，飼料由南通特羅菲飼料科技有限公司提供，血糖儀和試紙購自魚躍公司。STZ和NA均購自Sigma公司。RPMI1640 培養(yǎng)基購自HyClone試劑公司。大鼠熒光抗體FITC-His48和PE-CD11b/c購自美國賽默飛世爾公司。IL-10、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)試劑盒購自江萊生物。大鼠外周血細胞分離試劑盒購自索萊寶公司。Cytoflex流式細胞儀是美國貝克曼庫爾特有限公司產品，酶標儀是美國賽默飛世爾科技公司產品。

1.2方法

1.2.1實驗分組、造模與給藥 同一批次的SD雄性大鼠32只，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組和造模組。造模方法如下，按參考文獻[17,18]，大鼠禁食不禁水12 h后，以65 mg/kg劑量腹腔注射新鮮配制的STZ溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配，避光冰上操作)，15 min后，腹腔注射110 mg/kg的 NA溶液，正常組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液和生理鹽水，分別于注射后第3天和第7天，尾靜脈取血檢測空腹血糖，兩次血糖值均≥11.1 mmol/L并伴有多飲、多食、多尿癥狀視為T2DM造模成功。隨機從正常組和糖尿病組選取8只分別作為正常組(NC)、糖尿病組(T2DM)、亞麻籽油干預對照組(NC+FO)和亞麻籽油干預組(T2DM+FO)。NC組和T2DM組脂肪主要為10%w/w玉米油，NC+FO組和T2DM+FO組是亞麻籽油等量代替玉米油，確保能量相等。

1.2.2標本采集 亞麻籽油連續(xù)干預5周后，禁食過夜，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血后，將其置于含EDTA-2K抗凝管中，4℃ 2 000 r/min離心10 min，分離出血漿和血細胞。

1.2.3外周血單細胞懸液的制備 用等體積的PBS稀釋大鼠新鮮血細胞，在離心管中加入和血細胞等體積的淋巴細胞分離液，將稀釋后血細胞平鋪于分離液上方，4℃ 2 000 r/min離心5 min后吸取白膜層，加入細胞清洗液洗滌白膜層細胞，4℃ 1 500 r/min 離心5 min后棄上清。然后加入適量紅細胞裂解液，1 500 r/min離心5 min后，清洗細胞，棄上清。最后加入RPMI1640重懸細胞，調整細胞懸液濃度為2×106個/ml，供后續(xù)實驗使用。

1.2.4脾臟單細胞懸液的制備 分離各組大鼠脾臟組織，將取出的脾臟放入培養(yǎng)皿中，加入適量RPMI1640后，分離研磨脾臟。300目濾膜過濾，4℃ 1 500 r/min離心5 min后棄上清，然后加入適量紅細胞裂解液，4℃ 1 400 r/min離心8 min，棄上清，用RPMI1640清洗細胞一次，如紅細胞過多，再裂解一次。RPMI1640重懸細胞，調整細胞懸液濃度為2×106個/ml，供后續(xù)實驗使用。

1.2.5流式細胞儀檢測MDSCs 吸取上述提取的細胞懸液各100 μl加入流式管中，分別加入1 μl 抗大鼠FITC標記的His48和PE標記的CD11b/c表面抗體，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min后，每管加入1 ml 細胞染色緩沖液，4℃ 1 400 r/min離心5min清洗細胞，棄上清，重復洗滌細胞一次，然后用濾紙將流式管管口吸干，最后加入300 μl RPMI1640重懸細胞，立即上機檢測。

1.2.6血漿中炎癥因子的檢測 IL-10、IL-1β和TNF-α按照江萊試劑盒說明書進行檢測。

2 結果

2.1FO對T2DM大鼠外周血中MDSCs的影響 實驗結果如圖1所示，在NC、T2DM、NC+FO和T2DM+FO組中，外周血中MDSCs的比例分別為(3.54±1.31)%、(7.44±1.67)%、(4.41±1.32)%和(9.62±2.12)%。T2DM組大鼠外周血中MDSCs比例顯著高于NC組(P<0.05)；與T2DM組比較，T2DM+FO組MDSCs比例顯著升高(P<0.05)。上述結果表明，F(xiàn)O干預T2DM大鼠可增加外周血MDSCs水平。

2.2FO對T2DM大鼠脾臟細胞中MDSC的影響 實驗結果如圖2所示，在大鼠脾臟細胞中，NC、T2DM、NC+FO和T2DM+FO組中MDSCs的比例分別為(3.84±1.37)%、(6.35±1.50)%、(4.10±1.33)%和(9.11±3.49)%。T2DM組大鼠脾臟細胞中MDSCs比例顯著高于NC組(P<0.05)；與T2DM組比較，T2DM+FO組脾臟中MDSCs比例顯著升高(P<0.05)。以上結果說明，F(xiàn)O可明顯增加T2DM大鼠脾臟細胞中MDSCs含量。

2.3FO對T2DM大鼠炎癥因子表達水平的影響，與NC組比較，T2DM組大鼠血漿IL-1β和TNF-α表達水平顯著升高(P<0.001)；FO干預后，血漿中IL-1β和TNF-α含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。T2DM+CO組IL-10含量低于NC+CO組，F(xiàn)O干預后IL-10含量升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

2.4各組大鼠血漿炎癥因子與MDSCs相關性分析 大鼠外周血(MDSCs vs.IL-1β：r=-0.785 5,P=0.002 5;MDSC vs.TNF-α:r=-0.820 4,P=0.001 1)和脾臟(MDSCs vs.IL-1β：r=-0.822 8,P=0.001 0;MDSCs vs.TNF-α:r=-0.809 5,P=0.001 4)中MDSCs含量和大鼠血漿中IL-1β、TNF-α呈負相關(圖4)。

圖1 流式細胞術檢測FO對T2DM大鼠外周血MDSCs比例的影響Fig.1 Flow cytometry analysis of percentage of MDSCs from peripheral blood in T2DM rats after FO interventionNote:*.P<0.05.

圖2 流式細胞術檢測FO對T2DM大鼠脾臟細胞中MDSCs比例的影響Fig.2 Flow cytometry analysis of percentage of MDSCs from spleen in T2DM rats after FO interventionNote:*.P<0.05.

圖3 ELISA檢測各組大鼠血漿IL-1β、TNF-α和IL-10水平Fig.3 ELISA analysis levels of plasma IL-1β,TNF-α and IL-10 in different groupsNote:*.P<0.05,***.P<0.001.

圖4 炎癥因子與外周血及脾臟中MDSCs相關性分析Fig.4 Correlation between inflammatory cytokines and MDSCs of peripheral blood and spleenNote:A，B.Correlation analysis between IL-1β and MDSCs in peripheral blood and spleen;C，D.Correlation between TNF-α and MDSCs in peripheral blood and spleen.

3 討論

T2DM屬于一種慢性低度炎癥狀態(tài)，TNF-α、IL-1β和 IL-6等促炎因子升高，抗炎因子IL-10降低[19,20]，炎癥因子通過調節(jié)免疫系統(tǒng)，從而參與T2DM的發(fā)生發(fā)展[21]。近年來研究顯示，T2DM的進展與慢性低度炎癥密切相關[22-26]。FO作為一種優(yōu)質的食用油，富含ω-3 多不飽和脂肪酸，可阻斷 NF-κB 信號通路，抑制多種炎癥因子的表達，降低炎癥反應[27,28]。除此之外，F(xiàn)O還具有抗動脈粥樣硬化、降血糖、降血壓、降血脂等多種作用[14,29]。

MDSCs是骨髓來源的具有免疫抑制作用的一群異質性細胞，主要包括：未成熟粒細胞、單核細胞、骨髓前體細胞和樹突樣細胞，在感染、炎癥及腫瘤中MDSCs的數(shù)量顯著增加[30,31]。有研究顯示，MDSCs可以抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的生成，促進抗炎因子IL-10的產生，發(fā)揮抑制炎癥作用[32]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在T2DM患者外周血和脾臟細胞中，MDSCs比例顯著增加，延緩了疾病的發(fā)生發(fā)展[33]。Yin等[34]通過動物模型研究證實，在MDSCs移植到T2DM小鼠體內后，發(fā)現(xiàn)轉移的MDSCs具有降低血糖和預防糖尿病發(fā)作的能力。目前為止尚未確定大鼠MDSC分子標志，CD11b/c、His48是當前研究中報道最多的譜系標志[35,36]，故本研究采用其作為檢測標志分子。

在本研究中，通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，T2DM組大鼠外周血和脾臟細胞中MDSCs比例明顯高于NC組；而相對于T2DM組，T2DM+FO組外周血和脾臟細胞中MDSCs比例也顯著增加，說明FO能夠使MDSCs在外周血和脾臟中大量增殖，抑制其向成熟的髓系細胞分化，從而發(fā)揮負向免疫調控的作用[37,38]。通過ELISA檢測大鼠血漿中細胞因子，發(fā)現(xiàn)T2DM組血漿炎癥因子IL-1β和TNF-α水平顯著高于NC組，此結果提示T2DM大鼠炎癥因子的表達升高，與之前的研究結果一致[19,20]，這可能和胰島素抵抗有關[39]。在FO干預后，T2DM+FO組IL-1β和TNF-α水平明顯降低，說明FO可有效改善T2DM的炎癥反應，可能與ALA激活GPR120和抑制TLR4下游信號通路有關[40,41]，為此我們將在接下來開展相關深入研究。在本研究中，抗炎因子IL-10在T2DM組減少，在T2DM+FO組增加，但是差異沒有統(tǒng)計學意義。分析外周血和脾臟細胞中MDSCs含量與血漿中IL-1β和TNF-α的相關性，發(fā)現(xiàn)MDSCs與炎癥因子IL-1β和TNF-α呈負相關，可能和MDSCs抑制炎癥因子的表達有關[10]。

綜上所述，F(xiàn)O可誘導T2DM大鼠的MDSCs在外周血和脾臟細胞中募集，并且降低血漿中炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量，延緩T2DM的進展，可為T2DM的免疫抑制治療提供新的思路。而且FO作為一種優(yōu)質食用油，安全實惠，提示其對T2DM的輔助治療具有良好應用前景。