劉瀏，張若鵬，王惠瑩，羅加歡，周寧，張媛媛

1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；

2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南 大理 671000；

3.大理大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究所，云南 大理 671000

隨著現(xiàn)代社會(huì)壓力與日劇增和環(huán)境污染的加重，一定程度上影響了人類的身體健康，且伴隨著國家二胎政策的開放，準(zhǔn)備生育二胎的家庭增多，而高齡產(chǎn)婦生育力存在著一定程度的下降，導(dǎo)致不孕癥發(fā)病率逐年上升，目前該病已成為嚴(yán)重影響我國居民生活質(zhì)量的第三大疾病[1]。而針對不孕癥主要是病因治療，在治療不理想的情況下，則行輔助生殖技術(shù)(assisted repruductive technology，ART)，以體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)應(yīng)用較為廣泛，但其影響因素眾多[2-3]，常常難以獲得令人滿意的結(jié)果。而目前針對IVF-ET患者妊娠率與SNP位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)性研究并不十分明確，因此，本研究探討SNP位點(diǎn)與IVF-ET患者妊娠率的關(guān)聯(lián)，以期能夠?yàn)镮VF-ET患者早期診斷及相關(guān)干預(yù)提供一定的依據(jù)，從而服務(wù)于臨床，造福于廣大不孕不育患者。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取于2017年12月至2018年5月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF-ET且符合以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的不孕癥患者330例，根據(jù)術(shù)后是否妊娠分為妊娠組120例和未妊娠組210例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡25~35周歲；②無吸煙史；③無雙側(cè)卵巢手術(shù)史；④卵巢功能正常；⑤宮腔正常；⑥雙方染色體檢查正常；⑦無傳染性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①卵巢功能異常；②內(nèi)分泌異常；③解剖異常；④男性精液異常；⑤生殖道感染。妊娠組平均年齡(31.30±3.58)歲，未妊娠組平均年齡(31.28±3.43)歲，兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測 采集兩組患者EDTA-K2抗凝血標(biāo)本4 mL，若未及時(shí)檢測，將標(biāo)本凍存于-20℃冰箱中待檢。檢測時(shí)，將標(biāo)本從冰箱取出，冰上解凍。采用Maglso Swab DNA Isolation Kit試劑盒、oKtopure自動(dòng)化核酸提取儀對樣本核酸進(jìn)行提取，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。根據(jù)基因上的SNP位點(diǎn)序列的分析結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，然后采用競爭性等位基因特異性PCR(KASP)法對所選基因進(jìn)行檢測。每孔PCR反應(yīng)體系為2×KASPV4.0 MasterMix 0.8μL、72×KASPassaymix 0.022μL、DNA template 0.8μL，根據(jù)要檢測的樣本數(shù)和檢測的SNP位點(diǎn)，配置相應(yīng)的MasterMix和assaymix混勻，轉(zhuǎn)到96孔板中，運(yùn)用LGC的IntelliQube儀器，將混合Mix和DNA模板依次加入384孔的PCR板小孔中，將PCR板進(jìn)行密封。啟動(dòng)儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。最后通過IntelliQube儀器對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光掃描，讀取熒光信號(hào)，通過散點(diǎn)圖獲得基因分型結(jié)果。

1.2.2 IVF-ET方法及妊娠判定 采用標(biāo)準(zhǔn)長方案進(jìn)行控制性超促排卵，卵泡成熟時(shí)，在超聲引導(dǎo)下行卵泡穿刺取卵，在取卵當(dāng)日，采用二層密度梯度離心法處理男方所取精液，行體外受精，18 h后將正常受精卵繼續(xù)進(jìn)行體外培養(yǎng)，第三天行胚胎移植，所剩胚胎依情況凍存或是繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，移植后繼續(xù)予以黃體酮支持療法。子宮內(nèi)膜分型如下：A型內(nèi)膜：常見于內(nèi)膜增生早期，典型三線型或多層子宮內(nèi)膜，外層和中央為強(qiáng)回聲線，外層與宮腔中線之間為低回聲區(qū)或暗區(qū)，內(nèi)膜厚度為4~9 mm。B型內(nèi)膜：常見于內(nèi)膜增生晚期，均一的中等強(qiáng)度回聲型，宮腔強(qiáng)回聲中線斷續(xù)不清，內(nèi)膜厚度9~12 mm。C型內(nèi)膜：常見于黃體期，均質(zhì)強(qiáng)回聲，無宮腔中線回聲，厚度10~14 mm。移植后第14天采血測血清HCG>5 U/L，或晨尿尿HCG檢測為陽性，診斷為生化妊娠，繼續(xù)采用黃體支持療法，6周后，超聲檢測到胎心活動(dòng)或者孕囊為妊娠成功，未檢測到胎心活動(dòng)或者孕囊為妊娠失敗，即未妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對所選基因進(jìn)行Hardy-Weinbrg平衡檢驗(yàn)，以保證所選樣本的隨機(jī)性，等位基因頻率計(jì)算：基因頻率=每組某等位基因數(shù)/該組兩等位基因數(shù)之和，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s))表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，并對各基因型行風(fēng)險(xiǎn)分析，計(jì)算其優(yōu)勢比(odds ratio，OR)，衡量研究因素與IVF-ET患者妊娠率的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，當(dāng)OR>1時(shí)，所研究基因型為妊娠成功的保護(hù)因素，當(dāng)OR<1時(shí)，所研究基因型為妊娠成功的危險(xiǎn)因素，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的移植胚胎類型和移植胚胎數(shù)比較 兩組患者的移植胚胎類型和移植胚胎數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的移植胚胎類型和移植胚胎數(shù)量比較(例)

2.2 兩組患者的子宮內(nèi)膜分型和子宮內(nèi)膜厚度比較 妊娠組A、B、C型子宮內(nèi)膜分別為36例、48例、36例，未妊娠組子宮內(nèi)膜分型分別為62例、85例、63例，兩組子宮內(nèi)膜分型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.01，P=0.99)；妊娠組子宮內(nèi)膜厚度為(11.00±1.91)mm，未妊娠組為(10.49±2.09)mm，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.98，P=0.33)。

2.3 兩組患者各基因型的表達(dá)率比較 在本次檢測的4個(gè)SNP位點(diǎn)當(dāng)中，經(jīng)Hardy-Weinbrg平衡檢驗(yàn)，rs6906021不符合遺傳平衡(χ2=8.58，P=0.01)。rs2300825(χ2=3.69，P=0.16)、rs2524005(χ2=4.66，P=0.10)、rs2855591(χ2=4.84，P=0.09)均符合遺傳平衡。rs2524005(C/T)、rs2855591(C/T)各基因型表達(dá)率在兩組患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs2300825(A/G)各基因型表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。妊娠組rs2300825多態(tài)性位點(diǎn)A等位基因頻率為87.1%，未妊娠組為80.0%，妊娠組顯著高于未妊娠組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且經(jīng)OR值分析發(fā)現(xiàn)rs2300825(A/G)、rs2300825(A/A)相比于rs2300825(G/G)可提高IVF-ET患者的臨床妊娠率，OR值分別為1.526、2.769，見表2~表4，部分基因位點(diǎn)分型散點(diǎn)圖見圖1。

表2 兩組患者各基因型的表達(dá)情況比較(例)

表3 rs2300825(A/G)等位基因頻率比較[例(%)]

表4 rs2300825位點(diǎn)各基因型OR值分析(例)

圖1 部分樣本基因分型散點(diǎn)圖

3 討論

分別對符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的兩組不孕癥患者行IVF-ET[4]，兩組患者的年齡、移植胚胎類型、移植胚胎數(shù)、子宮內(nèi)膜分型、子宮內(nèi)膜厚度相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性，且以上因素對臨床妊娠率沒有影響。

隨著近年來不孕不育發(fā)病率逐漸升高，IVF-ET應(yīng)用逐步普及，但目前我國行體外受精-胚胎移植首次的成功率僅有30%左右[5]，且即使妊娠成功，也有眾多因素影響患者成功誕下胎兒[6]。HLA與人體免疫功能、免疫狀態(tài)及自身免疫易感性密切相關(guān)[7-8]，人體受孕本就是一個(gè)免疫過程，胚胎相對于母體是一種半同體抗原，研究表明多種不良妊娠情況都與HLA多態(tài)性相關(guān)[9-10]。HLA是人類主要組織相容性復(fù)合體的產(chǎn)物，位于第6號(hào)染色體短臂上，HLA分為HLA-I和HLA-II，其中，Ⅰ類由HLA-A、B、C位點(diǎn)編碼，Ⅱ類抗原受控于HLA-D區(qū)(包含5個(gè)亞區(qū)：DP,DM,DO,DQ和DR)。本次研究中所篩選的4個(gè)SNP位點(diǎn)中，rs2524005、rs2855591位于HLA-A*0303區(qū)，rs6906021、rs2300825位于HLA-DQB*0502區(qū)。其中，rs2300825、rs2524005、rs2855591符合Hardy-Weinbrg平衡，表明本次研究所納入的群體具有較強(qiáng)的代表性。兩組患者中，rs2300825各基因型表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)等位基因頻率分析，妊娠組A等位基因頻率為87.1%，未妊娠組A等位基因頻率為80.0%，妊娠組A等位基因頻率略高于未妊娠組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，通過對rs2300825位點(diǎn)各基因型OR值分析得出，rs2300825(A/G)、rs2300825(A/A)相比于rs2300825(G/G)可提高IVF-ET患者的臨床妊娠率，OR值分別為1.526、2.769。因此，本研究結(jié)果提示rs2300825位點(diǎn)多態(tài)性與IVF-ET患者臨床妊娠率存在一定的相關(guān)性，A等位基因的高表達(dá)可能為妊娠成功的保護(hù)因素。

HLA-DQ是體內(nèi)重要的抗原提呈分子，而針對于IVF-ET患者，所移植胚胎在宮腔內(nèi)種植成功是影響IVF-ET妊娠成功的一個(gè)重要因素，因此，推測HLA-DQ在這一過程中扮演著重要的作用，調(diào)控某些重要環(huán)節(jié)，在免疫性不孕不育中，其重要性已得到認(rèn)可[11-12]。夫妻雙方HLA-DQ分子相容性在多方面廣為探討，如淋巴細(xì)胞免疫治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)效果、胚胎種植等方面，不同學(xué)者持不同觀點(diǎn)。有學(xué)者認(rèn)為夫妻HLA的相容性增加，更易形成純合型胚胎妊娠，使母體的免疫調(diào)節(jié)失衡從而導(dǎo)致種植失敗，這種情況下一般采取供者淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法，療效較好[13]，但也有學(xué)者認(rèn)為，HLA-DQA1/DQB1組織相容性增高對封閉抗體的產(chǎn)生無影響[14]。有學(xué)者通過研究反復(fù)種植失敗患者與正常對照組相容性對比分析中，發(fā)現(xiàn)夫妻雙方HLA-DQ相容性與胚胎種植成功與否無顯著關(guān)聯(lián)[15]。該學(xué)者同時(shí)認(rèn)為，HLA-DQB1*03可能是一個(gè)導(dǎo)致IVF-ET患者反復(fù)種植失敗的易感基因，而HLA-DQB1*05:02可能是一個(gè)保護(hù)性基因，這與本研究部分結(jié)果一致。

綜上所述，HLA分子特定基因型的表達(dá)率影響著IVF-ET患者的臨床妊娠率，其中，rs2300825 A等位基因的高表達(dá)為IVF-ET患者妊娠成功的保護(hù)因素，而rs2524005、rs2855591在本次研究中兩組患者之間分布無明顯區(qū)別，可能原因是本次研究中所納入樣本量較少而使分析結(jié)果呈陰性，仍需大量臨床數(shù)據(jù)佐證，同時(shí)，日后可進(jìn)一步研究夫妻雙方HLA分子相容性對IVF-ET的影響。本次研究提示HLA基因多態(tài)性影響著臨床妊娠率，但其相關(guān)機(jī)制如何及是否可以進(jìn)行干預(yù)仍有待進(jìn)一步的研究，這些研究結(jié)果將會(huì)對IVF-ET患者有所助益，從而提高IVF-ET患者妊娠率并進(jìn)一步改善妊娠結(jié)局，具有一定的臨床意義和社會(huì)學(xué)意義。