范宇，王南，高原，王宇，傅少志，文慶蓮

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科健康管理部，四川 瀘州 646000

子宮內(nèi)膜癌是源自女性生殖系統(tǒng)的三種主要腫瘤之一。在許多國家，其發(fā)病率高于宮頸癌，并且位于婦科惡性腫瘤的第一位[1-2]。子宮內(nèi)膜癌患者經(jīng)常出現(xiàn)陰道異常出血；雖然許多患者在疾病仍然局限于子宮時(shí)被診斷出來，但大約30%的患者在其晚期被診斷。大多數(shù)用于治療晚期和復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的臨床試驗(yàn)僅顯示出有限的生存獲益，并且在過去幾年中死亡率急劇增加[3-4]。異常的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變已被廣泛認(rèn)為與子宮內(nèi)膜癌有關(guān)[5-6]。然而，遺傳學(xué)標(biāo)記尚未被證實(shí)可用于從整體上鑒定疾病，特別是散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌。異常DNA甲基化是被最廣泛研究的表觀遺傳修飾之一，在子宮內(nèi)膜癌中具有關(guān)鍵作用[7-8]。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基于基因甲基化的診斷標(biāo)記，并且已經(jīng)顯示出用于檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌的可能，而異常DNA啟動(dòng)子甲基化已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生早期和廣泛的改變[9]。然而，目前缺乏子宮內(nèi)膜癌的有效診斷生物標(biāo)志物，并且迫切需要新穎、準(zhǔn)確的標(biāo)志物。既往的研究已經(jīng)提示了組織樣本中異常基因甲基化作為子宮內(nèi)膜癌的潛在診斷生物學(xué)標(biāo)志物的用途，并且其結(jié)果令人鼓舞但是具有差異性。因此，需要通過進(jìn)一步研究來描述不同抑癌基因中DNA甲基化與散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的臨床病理特征間的關(guān)聯(lián)。因此亟待更新關(guān)于DNA甲基化和散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌這一主題的薈萃分析，原因如下：研究該主題的一些其他研究和試驗(yàn)已經(jīng)發(fā)表，因此可以更全面地綜合性分析數(shù)據(jù)；其他同樣適用于研究DNA甲基化在癌癥特征描述中的影響(前期研究顯示DNA甲基化與臨床病理學(xué)特征之間僅存在一個(gè)顯著相關(guān)性)；子宮內(nèi)膜癌中潛在的新的抑癌基因已被納入在內(nèi)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 通過系統(tǒng)的文獻(xiàn)檢索，確定了DNA甲基化作為散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物的研究。本研究在PubMed、EBSCO、Google Scholar和Embase數(shù)據(jù)庫中搜索了2018年10月31日之前發(fā)布的所有相關(guān)的英文文章，并使用以下關(guān)鍵字組合進(jìn)行文獻(xiàn)搜索：[tissue(or)sample(or)specimen(or)circulating cell free DNA(or)cfDNA(or)ctDNA(or)circulating tumor DNA(or)circulating tumor cell(or)CTC(or)blood(or)white blood cell(or)serum(or)plasma](and)[endometrial(or)endometrioid(or)endometrium(or)endometria](and)[neoplasm(or)cancer(or)tumor(or)carcinoma(or)adenocarcinoma(or)malignancy](and)[methylation(or)methylated(or)hypermethylation(or)hypomethylation]。兩名研究者獨(dú)立地進(jìn)行了評(píng)估并通過文章的標(biāo)題和摘要進(jìn)行篩選。本文作者對(duì)所有研究進(jìn)行了評(píng)估和討論，直至達(dá)到一致的篩選標(biāo)準(zhǔn)。系統(tǒng)回顧和薈萃分析的首選報(bào)告項(xiàng)目(preferred reporting items for systematic reviews and meta-analyses，PRISMA)[10]被用作文獻(xiàn)搜索過程的模板。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 重復(fù)的文章在合并數(shù)據(jù)庫中檢索的文章后被刪除，通過審查標(biāo)題和摘要進(jìn)行初步篩選，并且排除了會(huì)議摘要、評(píng)論和社論，僅有全文形式的原始研究被包括。本研究還排除了不關(guān)注組織中DNA甲基化變化，且不是散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌檢測(cè)/診斷背景的文章。在第一輪審查和排除后，根據(jù)以下排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步全文審查以獲得最終納入文獻(xiàn)：沒有健康正常個(gè)體或?qū)φ盏难芯?例如不考慮僅有配對(duì)樣本或良性疾病的研究)；不是病例對(duì)照研究；沒有報(bào)告或無法從公布的數(shù)據(jù)計(jì)算出對(duì)散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌診斷的敏感性和特異性值的研究；樣本量小(n≤10)的研究；以及基于細(xì)胞系或動(dòng)物模型而不是人類臨床樣本進(jìn)行的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取與統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)紐卡斯?fàn)?渥太華量表(newcastle-ottawa scale，NOS)[11]，兩名研究者獨(dú)立審查和評(píng)估了符合條件的研究，并且認(rèn)為被授予五顆星或更多的研究是高質(zhì)量的。然后，兩位作者使用Cochrane協(xié)作工具(Cochrane干預(yù)系統(tǒng)評(píng)價(jià)手冊(cè)5.1.0版)的標(biāo)準(zhǔn)化形式提取以下數(shù)據(jù)：第一作者、出版年份、地區(qū)、樣本量、檢測(cè)技術(shù)、生物標(biāo)志物、改變類型、診斷敏感性和特異性值以及偏倚風(fēng)險(xiǎn)。使用標(biāo)準(zhǔn)化方法評(píng)估以下偏倚風(fēng)險(xiǎn)項(xiàng)目：隨機(jī)順序生成、分配隱藏、患者和研究人員雙盲、結(jié)果評(píng)估盲法、不完整結(jié)果數(shù)據(jù)、選擇性報(bào)告和其他偏倚。所有作者通過進(jìn)一步討論解決了任何分歧。如果沒有明確報(bào)告甲基化值，則盡可能從可用的表格或圖中提取信息。通過Meta-DiSc分析[12]診斷變量，如敏感性、特異性、陽性似然比(positive likelihood ratio，PLR)和陰性似然比(negative likelihood ratio，NLR)，診斷比值比(diagnostic odds Ratio，DOR)和受試者工作特性曲線，以評(píng)估散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的甲基化基因的診斷價(jià)值或準(zhǔn)確性。PLR>5.0和NLR<0.2被認(rèn)為具有臨床意義。DOR代表甲基化基因患者與無甲基化患者相比，子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)增加。使用Review Manager 5.3分析敏感性和發(fā)表偏倚，并使用漏斗圖呈現(xiàn)發(fā)表偏倚。當(dāng)I2>50%時(shí)，認(rèn)為存在顯著的異質(zhì)性。如果研究之間存在異質(zhì)性，則使用隨機(jī)效應(yīng)模型合并分析結(jié)果；否則采用固定效應(yīng)模型。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)特征 系統(tǒng)文獻(xiàn)檢索的工作流程如圖1所示。PubMed、EBSCO、Google Scholar和Embase的主要檢索發(fā)現(xiàn)了1 448篇文章，其中851篇是重復(fù)的文章，再對(duì)標(biāo)題、摘要和全文篩選過濾后，最初獲得了134項(xiàng)研究。進(jìn)一步根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)排除了108項(xiàng)研究：基于使用體外/離體細(xì)胞系和人異種移植物13項(xiàng)研究；41項(xiàng)研究沒有健康的正常對(duì)照；15項(xiàng)不是病例對(duì)照研究；33項(xiàng)研究不可提取或計(jì)算診斷靈敏度和特異性；6項(xiàng)研究的樣本量很小(n≤10)。所有納入的研究都集中探討組織DNA甲基化或高甲基化。因此，系統(tǒng)文獻(xiàn)檢索最終獲得了26項(xiàng)研究，包括2 299例參與者(1 676例散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者和623名正常個(gè)體)。沒有患者接受過術(shù)前化療、放療或激素治療。納入的研究發(fā)表于2001—2018年，分別來自于10個(gè)國家或地區(qū)(中國、捷克共和國、香港、日本、韓國、荷蘭、俄羅斯、斯洛伐克共和國、臺(tái)灣和美國)(表1)。這些研究的樣本量范圍為19~156(中位數(shù)87)。18項(xiàng)研究評(píng)估了單個(gè)基因甲基化的診斷價(jià)值，5項(xiàng)研究評(píng)估多個(gè)基因，其他3項(xiàng)研究評(píng)估單基因和組合基因。再者，21項(xiàng)研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation specific PCR，MSP)檢測(cè)基因的甲基化情況，3項(xiàng)研究采用結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)，1項(xiàng)采用定量MSP(quantitative methylation-specific PCR，qMSP)，1項(xiàng)采用MSP和COBRA分別用于兩個(gè)基因的檢測(cè)。DNA甲基化生物學(xué)標(biāo)志物的具體細(xì)節(jié)及其診斷能力顯示在表2中。所有26篇選擇性納入的文章由兩位研究者進(jìn)行評(píng)估和檢查，并且根據(jù)NOS量表觀察到均具有高水平的方法學(xué)質(zhì)量(超過五顆星)。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程圖(截至2018年10月31日)

表1 納入研究文獻(xiàn)的主要特征

表2 甲基化生物學(xué)標(biāo)志物的具體細(xì)節(jié)及其診斷能力

2.2 診斷價(jià)值的薈萃分析 本研究評(píng)估了每項(xiàng)研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)。每個(gè)項(xiàng)目的詳細(xì)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果分別顯示在表3和圖2中，偏倚風(fēng)險(xiǎn)總結(jié)在圖3中。大多數(shù)納入研究中偏倚的風(fēng)險(xiǎn)高或不明確。4項(xiàng)研究表明參與者順序是隨機(jī)產(chǎn)生的。在69%的研究中報(bào)告了所有評(píng)估的甲基化生物學(xué)標(biāo)志物的診斷值，表明沒有選擇性報(bào)告。9項(xiàng)研究沒有其他偏倚，被定義為低風(fēng)險(xiǎn)。本研究合并了26項(xiàng)研究用于診斷準(zhǔn)確性的薈萃分析。合并敏感性和特異性分別為0.92(95%置信區(qū)間：0.91~0.94)和0.48(95%置信區(qū)間：0.46~0.50)(圖4)。DNA甲基化的存在對(duì)于散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)具有相對(duì)高的診斷能力(曲線下面積=0.8743)(圖5)。陽性擬然比和陰性擬然比分別為1.98(95%置信區(qū)間：1.76~2.22)和0.16(95%置信區(qū)間：0.11~0.21)，合并診斷比值比為17.64(95%置信區(qū)間：11.64~26.74)。在這些研究的診斷薈萃分析中觀察到顯著的異質(zhì)性(敏感性：I2=70.2%，P<0.001；特異性：I2=86.2%，P<0.001)。根據(jù)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)沒有顯著的閾值效應(yīng)(P=-0.172，P=0.178)。因此，亞組分析(表4)根據(jù)五個(gè)不同的參數(shù)進(jìn)行：樣本量(≤85與>85)、改變類型(甲基化與高甲基化)、種族(黃種人與白種人)、檢測(cè)方法(MSP、COBRA與qMSP)和目標(biāo)基因(單一、任何一種與兩種基因)。敏感性的低異質(zhì)性僅在COBRA亞組(敏感性：I2=44.8%，P=0.143)、qMSP亞組(敏感性：I2=0%，P=0.547)、任何一個(gè)基因亞組(敏感性：I2=0%，P=0.920)和兩個(gè)基因亞組(敏感性：I2=0%，P=1.0)中檢測(cè)到；而特異性的低異質(zhì)性在白種人亞組(特異性：I2=42.1%，P=0.069)和任何一個(gè)基因亞組(特異性：I2=0%，P=1.0)中被發(fā)現(xiàn)。診斷比值比的亞組分析揭示了高甲基化、COBRA、qMSP和任何一個(gè)或兩個(gè)基因的同質(zhì)趨勢(shì)(高甲基化：I2=49.9%，P=0.062；COBRA：I2=0%，P=0.871；qMSP：I2=0%，P=0.994；任何一個(gè)基因：I2=0%，P=0.998；兩個(gè)基因：I2=32.65，P=0.157)。這些結(jié)果表明甲基化檢測(cè)方法和基因組合的類型可能有助于降低異質(zhì)性。表4總結(jié)了亞組診斷價(jià)值的其他指標(biāo)?；谶@些因素的薈萃回歸分析也用于探索可能的異質(zhì)性來源，如表5所示，只有檢測(cè)方法才能顯著改變?cè)\斷價(jià)值的異質(zhì)性(P<0.001)?？傊?，本研究認(rèn)為檢測(cè)方法和基因組合是異質(zhì)性的主要因素。因此，需要使用不同檢測(cè)方法的精心設(shè)計(jì)的研究來闡明基因甲基化在散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌中的診斷作用。

表3 偏倚風(fēng)險(xiǎn)的詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)

圖2 偏倚風(fēng)險(xiǎn)匯總(綠色：低風(fēng)險(xiǎn)；黃色：不確定風(fēng)險(xiǎn)；紅色：高風(fēng)險(xiǎn))

圖3 偏倚風(fēng)險(xiǎn)圖(對(duì)偏倚項(xiàng)目每一風(fēng)險(xiǎn)的判斷，以納入研究的百分比表示)

圖4 診斷準(zhǔn)確性的森林圖

2.3 散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者DNA甲基化與臨床病理特征的關(guān)系 本研究基于16項(xiàng)不同的研究評(píng)估了DNA甲基化與散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者的幾種臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，其中3項(xiàng)涉及多個(gè)基因。沒有分析與DNA甲基化相關(guān)的年齡，因?yàn)椴煌芯康幕颊咧g無統(tǒng)一的年齡界值。甲基化狀態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期顯著性相關(guān)(淋巴結(jié)陰性/陽性，合并比值比：0.34，95%置信區(qū)間：0.19~0.59，P<0.001；Ⅰ~Ⅱ/Ⅲ~Ⅳ，合并比值比：0.62，95%置信區(qū)間：0.45~0.85，P=0.003)(表6)，提示基因甲基化與散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期的風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)，因此可能預(yù)后相對(duì)較差。然而，基因甲基化與體重指數(shù)(≤25.9/>25.9，合并比值比：1.04，95%CI：0.44~2.47，P=0.92)、病理類型(子宮內(nèi)膜樣/其他，合并比值比：0.63，95%CI：0.21~1.88，P=0.41)、組織學(xué)分級(jí)(G1/G2~3，合并比值比：0.82，95%CI：0.46~1.46，P=0.50)和侵襲(<1/2/≥1/2，合并比值比：0.59，95%CI：0.22~1.57，P=0.29)無顯著相關(guān)性，見圖5。

表4 診斷參數(shù)的亞組分析

表5 診斷價(jià)值的薈萃回歸分析

2.4 敏感性分析和發(fā)表偏倚 通過一次移除一項(xiàng)研究，進(jìn)行敏感性分析以評(píng)估結(jié)果的穩(wěn)定性。然而，這并未顯著影響合并比值比或異質(zhì)性指數(shù)，表明本次薈萃分析的穩(wěn)定性。漏斗圖相對(duì)對(duì)稱，基本沒有一項(xiàng)研究落在漏斗外(圖6)，這表明在散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者的基因甲基化薈萃分析中沒有顯著的發(fā)表偏倚。

圖5 含95%置信區(qū)間的受試者工作特性曲線圖(summary receiver operating characteristic，SROC)

表6 DNA甲基化與臨床病理特征相關(guān)性的薈萃分析

圖6 評(píng)價(jià)發(fā)表偏倚的漏斗圖

3 討論

DNA甲基化在既往研究中已經(jīng)證明可能成為子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)標(biāo)志物，其在子宮內(nèi)膜癌和正常組織之間顯示出明顯不同的甲基化模式[39]。DNA甲基化的改變反映了子宮內(nèi)膜癌發(fā)生過程中的基因轉(zhuǎn)錄變化。根據(jù)最近的綜述，許多研究已經(jīng)探討了子宮內(nèi)膜癌中不同基因的異常啟動(dòng)子甲基化[40]。此外，來自一項(xiàng)全基因組甲基化數(shù)據(jù)的分析提示了DNA甲基化生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷和預(yù)后的效用[41]。盡管與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的DNA甲基化研究目前仍處于臨床前階段，但許多結(jié)果提示了其臨床用作診斷、預(yù)后和治療反應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志物以及表觀遺傳治療靶點(diǎn)的潛力。然而，盡管P16和RASSF1A的異常甲基化對(duì)子宮內(nèi)膜癌診斷具有一定的敏感性和特異性[42-43]，但是其他基因(例如ER、PR、MLH1、MGMT、APC和CDH1)的異常甲基化已經(jīng)顯示出用于子宮內(nèi)膜癌診斷的準(zhǔn)確性差異[40]。

本研究基于前期研究，再次評(píng)估了散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的甲基化標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確性?？傮w而言，DNA甲基化對(duì)診斷的合并敏感性和特異性分別為0.92和0.48，并且DNA甲基化的存在對(duì)于散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)具有相對(duì)高的診斷能力(曲線下面積=0.8743)，但特異性相對(duì)較低(0.48)。就敏感性而言，DNA甲基化是化學(xué)穩(wěn)定的，并且在其他腫瘤中顯示出高靈敏度[44]。目前的證據(jù)表明，甲基化基因優(yōu)于單獨(dú)或聯(lián)合使用的CA125等血清蛋白標(biāo)志物，CA125診斷靈敏度僅為40%~80%[45-46]。子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷目前依賴于超聲、磁共振成像和CA125的組合，盡管這些檢查手段都不是完全令人滿意。CA125通常用作卵巢癌的血清標(biāo)志物，但也被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌良好的預(yù)后標(biāo)志物[45]。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的存在被認(rèn)為對(duì)某些癌癥具有高度特異性，主要是因?yàn)槟[瘤DNA中鑒定的體細(xì)胞突變不存在于正常DNA中，而基因甲基化可能發(fā)生在正常和癌癥DNA中[47]。本研究證實(shí)，臨床樣本中DNA甲基化的檢測(cè)對(duì)子宮內(nèi)膜癌具有相對(duì)較低的診斷特異性(合并特異性：0.48，95%CI：0.46~0.50)，這表明需要更具特異性的甲基化基因。

目前的研究包括基因甲基化或高甲基化改變，這可能導(dǎo)致大多數(shù)情況下腫瘤抑制基因的異常沉默。與這些類型的基因改變一致，最常見的甲基化檢測(cè)方法是MSP，其具有包括相對(duì)高的靈敏度等各種優(yōu)點(diǎn)[48]。在本次薈萃分析中，多項(xiàng)研究檢測(cè)到MLH1、CDH1和RASSF1A基因甲基化。MLH1被確定為異常DNA錯(cuò)配修復(fù)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability，MSI)的原因，其功能障礙可能與Lynch綜合征(也稱為遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌綜合征，hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome，HNPCC)有關(guān)[49]。盡管在許多子宮內(nèi)膜癌患者中檢測(cè)到MSI，但其突變頻率極低，這表明它可能是MSI陽性子宮內(nèi)膜癌患者中啟動(dòng)子異常甲基化的結(jié)果[18]。此外，除了qMSP，子宮內(nèi)膜癌的異常DNA甲基化的診斷價(jià)值不受所用技術(shù)的顯著影響，表明這種測(cè)定可能顯示出更高的特異性?；蚣谆瘶?biāo)記物的組合在散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌中也顯示出潛在的更高的診斷準(zhǔn)確性。

本項(xiàng)研究清楚地表明，檢測(cè)基因甲基化模式可以為散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌提供高敏感性但低特異性的診斷方式。子宮內(nèi)膜癌患者中DNA甲基化的存在可預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期腫瘤和不佳預(yù)后。目前缺乏用于子宮內(nèi)膜癌診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，因此甲基化標(biāo)志物可用于區(qū)分陰道出血異常女性的惡性或非惡性原因。需要尚需進(jìn)一步的薈萃分析，以使用更為準(zhǔn)確的甲基化基因和合適的檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)迫切需要利用一致性和標(biāo)準(zhǔn)化方法的更多前瞻性研究來解決這些問題。這項(xiàng)研究還存在一些局限性。首先，由于報(bào)告陽性結(jié)果的傾向性，可能已經(jīng)發(fā)生選擇偏倚，并且一些選定文獻(xiàn)中相對(duì)較小的樣本量也可能導(dǎo)致偏倚。此外，使用不同的MSP引物或設(shè)備，以及散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌中缺乏廣泛接受的甲基化基因也可能是偏倚的潛在來源。最后，甲基化相關(guān)生存預(yù)后及來自宮頸刷等其他部位組織的進(jìn)一步分析可以幫助在子宮內(nèi)膜癌中找到潛在的DNA甲基化生物學(xué)標(biāo)志物。