王天琦, 余瓊衛(wèi), 馮鈺锜

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 武漢 430072)

根據(jù)病因可將糖尿病分為4類, 其中2型糖尿病(T2D)是由胰島素抵抗導(dǎo)致的胰島素相對(duì)分泌不足引起的一類糖尿病[1,2]. 研究[3]表明, 咪唑丙酸是尿刊酸經(jīng)尿刊酸還原酶(UrdA)作用后的代謝產(chǎn)物[4], 其通過(guò)激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(Mammalian target of rapamycin, mTORC1), 促進(jìn)胰島素受體蛋白底物分子(IRS)分解, 引起人的胰島素抵抗, 從而導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生. 在2型糖尿病患者的腸道中, 可觀察到通過(guò)尿刊酸代謝產(chǎn)生咪唑丙酸的菌群的豐度明顯提高.

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一類在分裂素、 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、 葡萄糖和脂肪酸)、 激素作用下調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和新陳代謝的細(xì)胞質(zhì)激酶. mTOR在幼年期對(duì)有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要, 但在生命后期將會(huì)驅(qū)動(dòng)有機(jī)體走向衰老. 而mTOR的超活化, 則會(huì)加速細(xì)胞老化、 凋亡, 引起內(nèi)分泌疾病、 胰島素抵抗等生理疾病[5]; 同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥, 如腎臟衰竭、 視網(wǎng)膜病及神經(jīng)病等. 由于咪唑丙酸通過(guò)激活mTORC1阻斷胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[3], 因此, 與mTOR超活化相關(guān)的疾病均有可能受到咪唑丙酸的影響. 而部分人在尚未確診糖尿病之前, 就已經(jīng)受到并發(fā)癥的困擾, 此時(shí), 可以通過(guò)檢測(cè)血清中咪唑丙酸的含量來(lái)區(qū)別潛在的糖尿病患者和正常人. 據(jù)統(tǒng)計(jì), 全世界有4.15億人患有糖尿病, 其中2型糖尿病患者占90%以上, 且預(yù)計(jì)有1.93億人是潛在的糖尿病患者[6]. 如此龐大的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明, 咪唑丙酸的準(zhǔn)確定量對(duì)于醫(yī)學(xué)診斷具有重要意義.

迄今, 關(guān)于咪唑丙酸含量的測(cè)定尤其是復(fù)雜生物樣品中咪唑丙酸的準(zhǔn)確定量分析方法鮮見(jiàn)報(bào)道. Koh等[3]為了證明人血清中的咪唑丙酸水平與葡萄糖耐受量相關(guān), 通過(guò)乙腈提取咪唑丙酸后, 再采用正丁醇進(jìn)行衍生, 然后采用HPLC-MS檢測(cè), 將其應(yīng)用于649個(gè)不同葡萄糖耐受量的個(gè)體. Glinton等[7]對(duì)1對(duì)UROC1基因突變但是發(fā)育良好的姐弟進(jìn)行了非目標(biāo)性代謝組學(xué)分析, 以80%甲醇溶液從血清中提取小分子化合物, 發(fā)現(xiàn)血清和尿液中的尿刊酸、 咪唑丙酸的特征性代謝紊亂, 說(shuō)明尿刊酸酶缺乏癥與智力發(fā)育遲緩之間并無(wú)直接關(guān)系. 但是, 由于血清中成分復(fù)雜[8], 基質(zhì)干擾嚴(yán)重, 且潛在糖尿病患者的咪唑丙酸含量較低, 僅通過(guò)簡(jiǎn)單的沉淀蛋白難以提高咪唑丙酸檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度, 因此需要一定的樣品前處理. 上述報(bào)道均著重于分析咪唑丙酸及其相關(guān)代謝物的生物學(xué)意義, 并未提及相關(guān)的方法學(xué)精密度與準(zhǔn)確度, 亟需補(bǔ)充.

由于Ni(Ⅱ)材料與咪唑環(huán)中的氮原子可產(chǎn)生特殊的配位作用, 故已有多種Ni(Ⅱ)材料被用于組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)的分離與純化[9～11]. 前文[12～14]通過(guò)液相沉積法在SiO2基質(zhì)上沉積NiO納米顆粒, 并將其用于多種苯并咪唑類農(nóng)獸藥的選擇性富集與純化. 基于此, 本文將NiO@SiO2用于血清中咪唑丙酸的萃取, 結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)對(duì)咪唑丙酸進(jìn)行了定量分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

四水合氟化鎳(NiF2·4H2O)、 硼酸(H3BO3)、 氨水溶液(NH3·H2O, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%)、 磷酸(H3PO4)、 磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、 磷酸鈉(Na3PO4)、 甲酸(FA)和甲酸銨(HCOONH4)均為分析純, 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 色譜純乙腈購(gòu)于德國(guó)默克公司; 去離子水由實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的Milli-Q超純水儀制備. 制備NiO@SiO2所用硅膠粒徑為37～54 μm(300～400目), 購(gòu)于上海阿拉丁圣湖科技股份有限公司; 咪唑丙酸購(gòu)于藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司, 用去離子水配制成1 mg/mL儲(chǔ)備液, 避光儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中; 4-硝基咪唑(內(nèi)標(biāo))購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 用去離子水配制成1 mg/mL儲(chǔ)備液, 避光儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中; 2型糖尿病人和正常人血清樣本由武漢中南醫(yī)院提供, 避光保存于-80 ℃冰箱中.

Shimadzu LCMS-8040型高效液相色譜-質(zhì)譜(日本Shimadzu公司)由20AD泵、 SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、 CTO-20A柱溫箱、 DGU-20A5R脫氣機(jī)和配有ESI電離源的三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀組成; 數(shù)據(jù)的采集和處理均通過(guò)LabSolution 5.80軟件完成.

1.2 樣品的前處理

1.2.1 NiO@SiO2的制備 參照文獻(xiàn)[12]采用液相沉積法制備NiO@SiO2. 先將1.05 g NiF2·4H2O溶于30 mL去離子水中, 攪拌3 h以上過(guò)濾得到NiF2飽和溶液. 將1.89 g H3BO3溶于50 mL去離子水中得到0.6 mol/L硼酸溶液. 將15 mL NiF2飽和溶液與25 mL 0.6 mol/L硼酸溶液均勻混合于50 mL離心管中, 得到沉積前驅(qū)液. 將1 g 活化后的層析硅膠加入該前驅(qū)液中, 于40 ℃連續(xù)振蕩72 h, 所得材料經(jīng)去離子水清洗, 然后于75 ℃烘干, 置于馬弗爐中煅燒1 h. 馬弗爐升溫條件: 以1 ℃/min速率升溫至200 ℃, 加熱1 h. 將200 mg制備的NiO@SiO2材料裝入 3 mL 聚丙烯注射器中作為固相萃取柱, 備用.

1.2.2 樣品的固相萃取(SPE) 取50 μL血清, 加入950 μL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋后混合均勻, 作為上樣液備用. 將NiO@SiO2SPE柱先用2 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)活化后, 取1 mL上樣溶液上樣; 然后以1 mL去離子水清洗SPE柱, 待清洗液全部通過(guò)萃取柱后, 用真空泵抽干萃取柱; 最后加入1 mL 1%氨水溶液解吸, 待解吸液全部通過(guò)萃取柱后用真空泵抽干萃取柱, 將解吸液收集到1.5 mL離心管中. 將解吸液冷凍旋轉(zhuǎn)蒸干, 以1 mL ACN/H2O(體積比95∶5)混合溶液復(fù)溶, 經(jīng)渦旋離心后取上層清液10 μL, 進(jìn)樣高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)進(jìn)行分析.

1.3 色譜及質(zhì)譜分析條件

1.3.1 色譜條件 Alltima HP HILIC色譜柱(150 mm×2.1 mm i.d., 3 μm). 流動(dòng)相A為0.5%甲酸-甲酸銨緩沖溶液(pH=2.33), 流動(dòng)相B為乙腈, 梯度洗脫程序: 0～3 min: 95% B; 3～5 min: 95%～60% B; 5～14.5 min: 60% B; 14.5～15 min: 60%～95% B; 15～40 min: 95% B. 流速為0.4 mL/min, 柱溫40 ℃, 進(jìn)樣量為10 μL.

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用正離子掃描, 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)咪唑丙酸, 設(shè)置母離子為141.0, 子離子為81.0的MRM定量通道. 脫溶劑(DL)管溫度為250 ℃, 加熱模塊溫度為400 ℃, 霧化氣流速3 mL/min, 干燥氣流速15 mL/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

SPE條件會(huì)影響其萃取回收率和結(jié)果的可靠性, 萃取條件主要包括吸附劑用量、 上樣液pH值、 解吸液組成及其用量, 實(shí)驗(yàn)對(duì)這些萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化. 采用100 ng/mL咪唑丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化SPE條件. 回收率的計(jì)算方法: 用咪唑丙酸經(jīng)NiO@SiO2萃取解吸后進(jìn)行LC-MS檢測(cè)的量除以相同濃度的咪唑丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LC-MS檢測(cè)后的量. 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.

2.1.1 上樣液pH的優(yōu)化 分別用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)上樣液pH值至3, 5, 7, 9, 11, 再進(jìn)行NiO@SiO2SPE實(shí)驗(yàn). 如圖1(A)所示, 當(dāng)上樣液pH=3和pH=9時(shí)咪唑丙酸的峰面積相對(duì)較高. 由于咪唑丙酸的分子結(jié)構(gòu)中含有咪唑環(huán), 環(huán)上的N原子有的具有堿性, 有的具有酸性, 隨著溶液pH值的改變, 分子存在形式也會(huì)變化, 從而與NiO@SiO2的作用不同. 考慮到酸性條件下SiO2基質(zhì)更穩(wěn)定, 后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用pH=3的上樣溶液.

Fig.1 Optimization of the extraction conditions(A) pH of sample matrix(3, 5, 7, 9 and 11); (B) NiO@SiO2 sorbent amount(10, 20, 50, 100, 150 and 200 mg); (C) six kinds of eluent solution: a. ammonium hydroxide/acetonitrile(1∶99, volume ratio); b. ammonium hydroxide/H2O(1∶99, volume ratio); c. ammonium hydroxide/H2O(5∶95, volume ratio); d. formic acid/H2O(1∶1000, volume ratio); e. formic acid/acetonitrile(1∶1000, volume ratio); f. H2O. (D) Eluent solution: ammonium hydroxide/H2O(1∶99, volume ratio).

2.1.2 吸附劑用量的優(yōu)化 考察了吸附劑用量分別為5, 10, 20, 50, 100, 150和200 mg條件下咪唑丙酸的回收率. 如圖1(B)所示, 在5～100 mg范圍內(nèi), 解吸液中咪唑丙酸的含量隨吸附劑用量的增大而增加, 吸附劑用量大于100 mg, 該值基本達(dá)到穩(wěn)定值. 而實(shí)際血清樣品中成分復(fù)雜, 含有蛋白質(zhì)、 多肽、 脂肪、 氨基酸、 激素和核苷衍生物等, 基質(zhì)干擾較嚴(yán)重, 因此, 在血清基質(zhì)中對(duì)吸附劑用量(100, 150, 200, 250和300 mg)進(jìn)行繼續(xù)優(yōu)化, 當(dāng)吸附劑用量為200 mg時(shí), 血清基質(zhì)的解吸液中咪唑丙酸的含量最高. 因此, 選擇200 mg為吸附劑用量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.1.3 解吸液的優(yōu)化 解吸液組成直接影響解吸效果. 分別考察了含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NH3·H2O的乙腈溶液、 含1% NH3·H2O的水溶液、 含5% NH3·H2O的水溶液、 含0.1% FA的水溶液、 含0.1% FA的ACN溶液及純水等6種解吸液對(duì)NiO@SiO2SPE柱萃取咪唑丙酸后的解吸效果. 結(jié)果如圖1(C)所示. 含有NH3的解吸液中NH3能與Ni2+配位與咪唑環(huán)形成競(jìng)爭(zhēng), 將咪唑丙酸洗脫下來(lái). 可見(jiàn), 含NH3·H2O的水溶液萃取效果較好, 其中含1%和5% NH3·H2O的水溶液解吸效果相差無(wú)幾, 因此, 在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用含1% NH3·H2O的水溶液作為解吸液. 然后分別以1.0, 2.0和3.0 mL含1% NH3·H2O的水溶液作為解吸液對(duì)SPE柱進(jìn)行解吸, 考察了不同解吸液用量的洗脫效果. 結(jié)果如圖1(D)所示, 1 mL解吸液用量時(shí)能夠解吸完全, 因此選擇1.0 mL 1% NH3·H2O的水溶液進(jìn)行解吸.

由于咪唑丙酸為親水性物質(zhì), 硅膠也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生吸附作用. 為了說(shuō)明NiO@SiO2與咪唑丙酸的作用機(jī)制, 在上述優(yōu)化后的萃取條件下通過(guò)比較NiO@SiO2與SiO2對(duì)咪唑丙酸的萃取效果發(fā)現(xiàn), 在SiO2材料上咪唑丙酸的回收率僅為0.3%, 而在NiO@SiO2材料上其回收率可達(dá)72.2%, 說(shuō)明NiO@SiO2與咪唑丙酸之間的吸附主要是基于NiO與目標(biāo)分析物之間的相互作用.

圖2(A)為血清樣品和添加2.5 ng/mL咪唑丙酸的血清樣品經(jīng)NiO@SiO2固相萃取后的色譜圖. 可見(jiàn), 咪唑丙酸的保留時(shí)間為6.89 min, 血清樣品在咪唑丙酸保留時(shí)間處無(wú)干擾. 圖2(B)為圖2(A)中咪唑丙酸出峰處的質(zhì)譜圖, 圖中m/z123.00和81.00處可歸屬為咪唑丙酸的2個(gè)特征子離子.

Fig.2 Chromatogram of serum and spiked serum with 2.5 ng/mL imidazole propionic acid after NiO@SiO2 SPE(A) and the mass spectrum of the chromatographic peak at 6.89 min(B)

2.2 方法學(xué)考察

最優(yōu)SPE條件下, NiO@SiO2對(duì)血清中咪唑丙酸的萃取回收率(Recovery, %)計(jì)算公式如下:

式中:A0為血清基質(zhì)中咪唑丙酸經(jīng)NiO@SiO2SPE萃取后測(cè)得的峰面積;Ai為加入10 ng/mL咪唑丙酸后的血清樣品經(jīng)萃取后測(cè)得的峰面積;As為血清基質(zhì)經(jīng)萃取后再添加10 ng/mL咪唑丙酸測(cè)得的峰面積. 血清中的咪唑丙酸在經(jīng)過(guò)NiO@SiO2SPE萃取后回收率為77.7%, 3次實(shí)驗(yàn)值的RSD為5.8%, 表明NiO@SiO2能充分萃取血清中的咪唑丙酸. 為了消除儀器檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng), 在隨后的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)中將硝基咪唑(160 ng/mL)作為內(nèi)標(biāo)對(duì)其進(jìn)行定量分析.

向血清樣本中加入不同濃度的咪唑丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液, 使上樣液濃度范圍為0.05～10 ng/mL, 每個(gè)濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次. 以分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo), 質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo), 得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程為y=0.1464x-0.0016(相關(guān)系數(shù)R2=0.996), 表明在0.05～10 ng/mL范圍內(nèi), 線性關(guān)系良好. 以3倍信噪比計(jì)算得出方法的檢出限為0.02 ng/mL, 10倍信噪比計(jì)算得到方法的定量限為0.05 ng/mL. 日內(nèi)、 日間精密度通過(guò)測(cè)定添加高、 中、 低(10, 1.0和0.25 ng/mL)3個(gè)濃度咪唑丙酸時(shí)的加標(biāo)回收率進(jìn)行評(píng)價(jià). 日內(nèi)精密度測(cè)定在1天內(nèi)重復(fù)5次實(shí)驗(yàn), 日間精密度測(cè)定在連續(xù)3天內(nèi)每天各重復(fù)3次實(shí)驗(yàn). 如表1所示, 加標(biāo)回收率為84.0%～119%, 日內(nèi)日間精密度在0.25%～17.2%之間, 表明這種方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度, 適用于血清樣品中咪唑丙酸的分析.

Table 1 Precisions and recoveries for the determination of imidazole propionic acid in serum

2.3 實(shí)際樣品分析

將建立的方法用于實(shí)際血清樣品中咪唑丙酸的分析, 表2分別列出了20位2型糖尿病人及20位正常人血清中咪唑丙酸含量的測(cè)定結(jié)果. 通過(guò)單因素方差分析可知, 2型糖尿病人與正常人血清中咪唑丙酸的含量存在顯著性差異(P<0.01), 與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致. 此結(jié)果進(jìn)一步擴(kuò)大了NiO@SiO2SPE的應(yīng)用范圍, 同時(shí)表明咪唑丙酸作為小分子代謝物在醫(yī)療診斷中的巨大潛力.

Table 2 Imidazole propionic acid amounts in Type 2 diabetes(T2D) patients and control

3 結(jié) 論

以NiO@SiO2作為固相萃取材料, 將NiO@SiO2SPE與高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)合, 建立了一種人血清中咪唑丙酸的分析方法. 該方法簡(jiǎn)單、 準(zhǔn)確度和精密度均較好, 將其應(yīng)用于2型糖尿病人與正常人血清中咪唑丙酸含量的檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)具有顯著性的差異. 本文結(jié)果不僅拓寬了液相沉積材料NiO@SiO2的使用范圍, 同時(shí)也表明咪唑丙酸在未來(lái)2型糖尿病以及其它并發(fā)癥的醫(yī)學(xué)診斷中具有較大的潛力. 在未來(lái)的疾病診斷中, 該方法有望用于疾病診斷的輔助指導(dǎo).