張紅巖，成光宇，初洪波，林艷玲，崔 暢

（1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

五味棗仁顆粒是由酸棗仁、刺五加、五味子、茯苓等原料經(jīng)提取、濃縮、干燥、混合、制粒等工藝制成的保健食品，經(jīng)動物實驗證明具有輔助改善睡眠功能。為了更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，我們對產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，采用薄層色譜法，對產(chǎn)品中各個原料進(jìn)行薄層色譜鑒別，得出結(jié)論，五味子的色譜特征明顯，陰性無干擾，重復(fù)性優(yōu)，列入標(biāo)準(zhǔn)正文；此外，采用高效液相色譜法，對五味棗仁顆粒中酸棗仁所含斯皮諾素進(jìn)行含量測定研究，建立了測定方法，對方法學(xué)進(jìn)行了考察。通過以上研究，建立了五味棗仁顆粒質(zhì)量控制方法，為更好保證產(chǎn)品質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（日本島津LC-10ATvp）、色譜工作站（日本LCsolution Lite）、電子分析天平（十萬分之一）（瑞士，梅特勒-托利多XS105 型）、紫外可見分光光度計（上海恒平科學(xué)儀器有限公司UV-2800 型）、超聲清洗儀（上海 生析超聲儀）、斯皮諾素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111869－201203，含量計95.4%）、五味子醇甲對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110857－201714，含量計99.9%）、五味棗仁顆粒（北京海德潤醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號：190401、190402、190403）、乙腈。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子薄層色譜鑒別 取五味子10 g，細(xì)磨，放入60 mL甲醇，置超聲波處理30 min。濾后，將濾液蒸干，殘渣加水10 mL使之盡量溶解。應(yīng)用三氯甲烷提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷的提取液，蒸干，殘渣追加甲醇1 mL 溶解，當(dāng)作供試品溶液。拿取五味子醇甲對照品，將其應(yīng)用甲醇制作成1 mL/1 mg 的溶液當(dāng)作對照品溶液。（中國藥典2015年版四部 通則0502實驗。拿取供試品溶液10 μL，和對照品溶液2 μL，兩者點置相同一個硅膠GF254薄層板。依據(jù)石油醚（30 ℃～60 ℃）—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1）上層溶液當(dāng)作展開劑，展開，并置晾干燥。擱置紫外燈（254 nm）檢視。對照品色譜匹配對應(yīng)的位置上跟供試品顯著同種顏色斑點，見圖1。

圖1 五味子薄層色譜鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱條件為Hichrom C18（4.6×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈—水（16:84）；檢測波長為335 nm。理論板數(shù)憑借斯皮諾素峰推出，不得不夠2 000。

2.2.2 制作對照品溶液 拿取足夠量的斯皮諾素對照品，稱量精密，放入甲醇制l mL/40 μg 的溶液，可得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品適當(dāng)量，研細(xì)，取2 g，準(zhǔn)確稱量置于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入70%，25 mL 乙醇。量重后開展超聲波處理（功率為250 w，頻率40 kHz）30 min，取出，置冷并重次量定重量。以70%乙醇補(bǔ)予減少的重量，搖勻過濾且匯集續(xù)濾液，既得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 核查線性范圍 精準(zhǔn)足量稱量斯皮諾素對照品，混合甲醇制濃度為0.1441 mg/mL 溶液。精準(zhǔn)依序吸量0.5 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL，分置10 mL 量瓶中，取來甲醇稀釋至各量瓶刻度后且搖勻。分別另取量上述對照品溶液各10 μL，憑據(jù)方法測定。設(shè)立橫坐標(biāo)斯皮諾素的量，縱坐標(biāo)設(shè)立峰面積，描畫標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.072～1.296 5 μg 之間范疇，斯皮諾素量，峰面積積分值互相存留優(yōu)良線性關(guān)系?；貧w方程：Y=2 263 672.93 X+6 620.25，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在不同時間點進(jìn)樣10 μL，測定峰面積積分值，選擇時間點分別為0、2、4、8、12、24、36、48 h。結(jié)果，不同時間點測得得峰面積積分值分別為：1 071 800、1 079 037、1 075 475、1 073 717、1 075 998、1 079 360、1 080 823、1 095 603，RSD%=0.68；結(jié)果顯明，樣品中的斯皮諾素2 天內(nèi)情況基本平穩(wěn)。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取10 μL 3.2.3 項下供試品溶液，憑據(jù)已篩選的色譜條件，連續(xù)針對同一供試品溶液進(jìn)樣6 次，檢測峰面積的積分值，結(jié)果，樣品中斯皮諾素峰面積積分值分別為：1 047 563、1 053 695、1 059 511、1 059 364、1 057 924、1 056 048，RSD%=0.43。測定結(jié)果展現(xiàn)，本法設(shè)備精密度優(yōu)良。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗 針對此批次的五味棗仁顆粒樣品依據(jù)3.2.3 項下方法制成供試品溶液，共計6 份，憑據(jù)方法測定后測定的6 次結(jié)果依次是：0.575 3、0.579 3、0.567 5、0.578 5、0.582 1、0.583 8 mg/g，平均值為0.577 8 mg/g，RSD%=1.01。測定最終結(jié)果表明此方法重復(fù)性優(yōu)。

2.2.4.5 加樣回收率實驗 取含量已知曉的五味棗仁顆粒6 份樣品（批號為190401,斯皮諾素的含量57.45 mg/100 g），分別加入一定量斯皮諾素對照品，依法測定后計算出回收率。結(jié)論可得：關(guān)于斯皮諾素的均回收率為98.31%，RSD%=1.2，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果

2.2.4.6 樣品的測定 憑據(jù)方法測定三批試樣品五味棗仁顆粒中的斯皮諾素含量，結(jié)果見表2。

表2 三批五味棗仁顆粒中斯皮諾素含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層色譜法 五味子來源五味子科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，大部分出現(xiàn)于遼寧省、吉林省、黑龍江及內(nèi)蒙古等地方，別稱北五味子。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，味酸、甘，歸肺、心、腎經(jīng)，主要功效為益氣滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神[1]。五味子包括多種成分，關(guān)鍵含有木脂素、揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、三萜、氨基酸及無機(jī)元素等等。其中重要成分為木脂素類物質(zhì)。其含五味子素、五味子甲素、五味子酯甲、新五味子素、五味子酯乙、五味子醇乙等等成分，大抵占有8%。2015 版《中國藥典》有實確規(guī)定，五味子藥材中蘊(yùn)含的五味子醇甲應(yīng)多于0.40%[2-3]中國藥典2015版一部五味子鑒別項下中采用藥材經(jīng)三氯甲烷提取后蒸干，加三氯甲烷溶解，作為供試品進(jìn)行鑒別，許多文獻(xiàn)方法也與藥典相同,也有直接用甲醇或乙酸乙酯超聲提取[4-11]進(jìn)行鑒別的。在本試驗中，由于本品是經(jīng)過水煎煮提取的，故在供試品溶液制備方法選擇上采用甲醇提取后蒸干，殘渣加水溶解，用三氯甲烷萃取后蒸干，用甲醇溶解做成供試品溶液，進(jìn)行鑒別，依據(jù)此法操作可除去大部分雜質(zhì)，所制備的供試品溶液不粘稠，易于點樣。擇選展開劑過程中，除去用屬于2015 版中國藥典一部五味子鑒別項下的展開體系石油醚（30～60 ℃）—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1）以外，也相比照了石油醚（60～90 ℃）—乙酸乙酯—甲酸（15:4.5:0.5）和環(huán)己烷—甲酸—乙酸乙酯（5:0.05:3）的分離效果。結(jié)果藥典所用展開劑系統(tǒng)的分離效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越二者。多次實驗表明，所應(yīng)用的薄層鑒別方法，斑點分離更清楚,重復(fù)性優(yōu),陰性無干擾,專屬性較強(qiáng)。

3.2 含量測定

3.2.1 專屬性試驗 在已經(jīng)選定的色譜條件下，樣品中斯皮諾素色譜峰前后并無雜峰干擾，顯示基本基線已經(jīng)分離，結(jié)果為圖2。

圖2 五味棗仁顆粒高效液相色譜圖

3.2.2 系統(tǒng)適用性試驗 在查閱了斯皮諾素含量測定文獻(xiàn)[12-22]基礎(chǔ)上，實驗比較了如下幾種色譜柱和流動相分離效果：色譜柱：1）HICHROM C18（4.6 mm·250 mm·5 μm）。2）Agilent Zorbax（250 mm·4.6 mm·5 μm）。3）Waters symmetry（4.6 mm·250 mm·5 μm）。流動相：1）乙腈—水（20:80）2）乙腈—水（18:82）3）乙腈-水（15:85）4）乙腈—水（16:84）5）乙腈（A）-水（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，88% B～81% B；10～16 min，81% B～80% B；16～22 min，80%B～0% B；22～30 min，0% B），結(jié)果表明，3 種色譜柱配合乙腈—水（16:84）流動相，均能使樣品中斯皮諾素與其它組分達(dá)到很好分離（分離度＞1.5），其中最優(yōu)的HICHROM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和乙腈—水（16:84）組合，分離效果最好，保留時間適宜，故作為本試驗的色譜條件。

3.2.3 耐用性試驗 拿取批號同一的樣品五味棗仁顆粒，依照上述測定條件，考查在測定條件有細(xì)微的波動時對測定結(jié)果作用程度。實驗首要考察由不同型號色譜柱及不等柱溫以及互異流動相配比等因素變動的條件下樣品五味棗仁顆粒中斯皮諾素含量的影響。

3.2.3.1 色譜柱 本實驗采用HICHROM-C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SYMMETRY-C18 的不同型號色譜柱進(jìn)行測定，結(jié)果在樣品中測得斯皮諾素的含量依次是：0.577 8、0.577 4、0.576 6 mg/g，斯皮諾素的含量于不同型號柱及同一批樣品中并無顯著變化。

3.2.3.2 柱溫 順次在20 ℃、30 ℃、40 ℃柱溫的條件量測樣品中斯皮諾素含量依次是：0.569 9、0.579 7、0.574 6 mg/g，結(jié)果：等批次樣品不同柱溫斯皮諾素含量無突出改變。

3.2.3.3 流動相 選擇乙腈—水（15:85）、乙腈—水（16:84）、乙腈—水（17:83）三個比例的流動相進(jìn)行觀察，結(jié)果斯皮諾素含量分別是0.573 4、0.580 7、0.582 4 mg/g。斯皮諾素含量在等批次不同流動相配比下無突出改變。

4 結(jié)語

上述試驗結(jié)果表明，在有輕微色譜條件改變時，斯皮諾素的含量在樣品中沒有明顯改變，產(chǎn)品薄層色譜鑒別和含量測定方式完美可行，重復(fù)性優(yōu)，此種方法擁具優(yōu)好的耐用性。