張 禹，黃秋思，劉 定，楊沈秋

（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001）

肝纖維化（Hepatic fibrosis,HF）是指肝臟遭到病毒性、代謝性、炎性和中毒性等諸多致病原侵襲，致使肝臟發(fā)生炎癥反應，引起肝臟組織內(nèi)細胞外基質(zhì)過度增生與異常沉積，進而導致肝臟正常生理結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變的病理過程，這種病理損害是多種慢性肝病向肝硬化進展的共同反應[1]?，F(xiàn)代研究證實，肝纖維化早期是一種可逆性病變[2]，并且在臨床患者中，這一結(jié)論也得到證實[3-4]。因此，及時有效的抗肝纖維化治療對肝病預后具有重要意義[5]。

以病理性血管新生為特點的肝竇毛細血管化是肝纖維化進程中的重要病理表現(xiàn)。研究證明，低氧誘導因子-1α（Hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被認為在血管生成和重構(gòu)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。本實驗將通過觀察疏肝化瘀益氣法為指導的軟肝散對大鼠肝纖維化過程中HIF-1α、VEGF mRNA 表達的影響，并探究其防治肝纖維化的作用機制。

1 實驗材料

健康的8～10 周齡清潔級雄性SD 大鼠46 只，體質(zhì)量（200±20）g，給予標準飼料和飲用水，自由飲水飲食，且控制室內(nèi)溫度為（22±1）℃、相對濕度60%～80%，正常飼養(yǎng)適應7 d 后開始實驗。軟肝散組成：黃芪、柴胡、丹參、炙鱉甲、生牡蠣。德國萊卡2135 型切片機，美國moticam3000 顯微攝影成像系統(tǒng)，Nikon Eclipse TE2000-E 倒置顯微鏡，HITACHI H-7650 透射電子顯微鏡，F(xiàn)resco 低溫冷凍離心機，電泳儀，Centrifuge 5415D 離心機，NC 膜，0.45 μm 孔徑，ABI7500 熒光定量PCR 儀，無菌豬血清，BCA 蛋白定量試劑盒，麗春紅染色液，蛋白酶抑制劑，山羊抗兔IgG（H+L），HRP，TRNzol 總RNA 提取試劑。

2 實驗方法

2.1 建立模型 雄性清潔級SD 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，給予腹腔注射未滅活的豬血清，每次0.5 mL/只，2 次/周，連續(xù)注射8 周。

2.2 動物分組 健康雄性清潔級SD 大鼠46 只，隨機分為空白組4 只，軟肝散干預組8 只，模型組34 只。

2.3 給藥方法 空白組、模型組，給予生理鹽水灌胃，1 次/d，至8 周末；軟肝散干預組自造模開始即給予軟肝散生藥水煎劑灌胃，1 次/d。并于第2、4、6、8 周，分別處死2 只大鼠取材，造模結(jié)束后全部處死。

2.4 標本采集 取材前大鼠禁食不禁水12 h，然后用4%水合氯醛按10 mL/kg 劑量腹腔注射，麻醉后固定解剖。取出大鼠肝臟，觀察肝臟的顏色、質(zhì)地，切取約2 mm厚的肝組織放入10%中性福爾馬林液中固定，常規(guī)制備肝組織切片，切片厚度約4 μm；另取1 mm3肝臟組織放入2.5%的戊二醛固定液中固定，于4 ℃冰箱保存；再分別取肝臟組織100 g 于液氮中速凍，再保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

2.5 檢測指標及方法 HE、Masson 染色病理組織學觀察，RT-PCR 方法、Western blot 法檢測HIF-1α、VEGF 蛋白定量。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗，等級資料比較采用非參數(shù)檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 HE 染色病理組織學觀察 見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織的病理形態(tài)變化（HE 染色，×200）

經(jīng)HE 染色分析可見，空白組肝細胞板排列規(guī)整，胞質(zhì)胞核染色清晰，未見炎細胞浸潤和充血。模型組肝組織纖維化，并被增生纖維組織分割包繞成不同的區(qū)域，胞質(zhì)胞核界限不清，胞質(zhì)染色不均勻，肝細胞腫脹，局部深染或呈現(xiàn)脂肪樣變性或液化性壞死灶；細胞核固縮或呈現(xiàn)分裂；散見炎細胞浸潤或局部充血。軟肝散干預組隨著給藥時間的增加，各時間點肝組織病理表現(xiàn)均有不同程度的減輕，2 周時病理變化主要以肝細胞脂肪樣變性為主，有輕度的纖維化，4 周、6 周、8周時肝板排列逐漸規(guī)整，胞質(zhì)胞核染色清晰，水腫明顯減輕，有少量的炎細胞存在，未見明顯的纖維組織增生。

3.2 Masson 染色病理組織學觀察 見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織的病理形態(tài)變化（Masson 染色，×200）

經(jīng)Masson 染色分析可見，空白組肝細胞間可見少許的淺藍色，面積很少且著色淡，主要分布在大的血管周圍。模型組肝細胞間可見大量的深藍色，且肝細胞周邊也呈現(xiàn)藍色，分布廣泛且著色深，表明肝纖維化明顯。軟肝散干預組：給藥預防組隨著給藥時間延長，肝臟藍色的區(qū)域和深淺逐漸減少和減弱，表明肝纖維化程度逐漸減輕。尤以8 周組最為明顯。

3.3 RT-PCR 方法檢測HIF-1α、VEGF 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF蛋白的相對表達量均顯著升高，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，軟肝散干預組（2周）、軟肝散干預組（4 周）、軟肝散干預組（6 周）、軟肝散干預組（8 周）大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF蛋白的相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且隨著干預給藥時間的延長，HIF-1α、VEGF 蛋白的相對表達量逐漸降低，具體見表1。

表1 Real Time PCR 檢測結(jié)果（）

表1 Real Time PCR 檢測結(jié)果（）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.4 Western blot 法檢測HIF-1α、VEGF 蛋白定量 首先能檢測到特異的陽性條帶，內(nèi)參檢測的檢測結(jié)果為正常陽性結(jié)果。采用Total Lab Quant V11.5（Newcastle upon Tyne,UK）軟件掃描灰度值，統(tǒng)計分析蛋白的相對表達量。與空白組比較，模型組大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF 蛋白的相對表達量均顯著升高，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，軟肝散干預組（2周）、軟肝散干預組（4 周）、軟肝散干預組（6 周）、軟肝散干預組（8 周）大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF蛋白的相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且隨著干預給藥時間的延長，HIF-1α、VEGF 蛋白的相對表達量逐漸降低，具體見圖3，表2。

圖3 各組大鼠肝組織HIF-1α、VEGF 蛋白的表達（）

表2 Westem bolt 檢測HIF-1α、VEGF 蛋白相對表達量結(jié)果（）

表2 Westem bolt 檢測HIF-1α、VEGF 蛋白相對表達量結(jié)果（）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01

4 討論

肝臟血管新生與肝纖維化的發(fā)生機制有一定的相關(guān)性，在肝纖維化的病人和實驗動物模型的肝臟，都發(fā)現(xiàn)明顯的肝竇毛細血管化[7-8]。肝竇是肝血流和肝細胞間多種代謝物質(zhì)交換的主要場所，毛細血管增生可以使肝細胞與血漿成分的交換出現(xiàn)障礙，進而導致肝細胞缺血缺氧，加重細胞損傷及肝星狀細胞活化及細胞外基質(zhì)異常沉積。

肝臟受到病原體侵襲后，肝臟會啟動創(chuàng)傷愈合反應，由于細胞迅速擴增，需要大量的血流及營養(yǎng)供應，遂導致肝組織局部缺氧。缺氧可引起肝內(nèi)血管重構(gòu)，已有體內(nèi)實驗模型發(fā)現(xiàn)肝臟缺氧區(qū)域是肝臟血管新生發(fā)生的主要位置。低氧誘導因子（HIF-1α）是一種在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控低氧反應基因的表達介導細胞對低氧的應答，使組織細胞對缺血、缺氧作出適應性反應[9]。大量研究證明，在與缺氧相關(guān)疾病如腫瘤、感染、炎癥反應、創(chuàng)傷等過程中，HIF-1α 作為參與機體應對缺氧代謝的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細胞代謝和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[10-11]。

在組織缺氧誘導因子（HIF-1α）的參與下，組織缺氧刺激肝臟細胞上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達。研究證明，VEGF可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞成活和增殖，而作為VEGF 的上游調(diào)控因子，HIF 不僅能促進其表達和轉(zhuǎn)錄增強，還能增加VEGFmRNA 的穩(wěn)定性，促進形成新血管，改善局部組織血供。HIF-1α 及其下游因子作為肝纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，有望成為緩解肝纖維化的有效途徑[12-13]。

肝纖維化屬于中醫(yī)“脅痛”范疇，從其病理特征來看，則屬于肝絡(luò)病范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，肝絡(luò)是指分布在肝臟區(qū)域中小血管、微血管、微循環(huán)，能夠濡養(yǎng)肝臟并調(diào)節(jié)肝臟代謝。這與肝竇的結(jié)構(gòu)與生理功能不謀而合。肝絡(luò)從經(jīng)脈別出，因與肝血、肝氣相通，故可分為血絡(luò)和氣絡(luò)。血絡(luò)如肝竇，承載和運輸血液，氣絡(luò)如肝竇內(nèi)的細胞，具有維持血絡(luò)結(jié)構(gòu)和提供動力的功能。由于肝竇與肝絡(luò)密不可分的聯(lián)系，從“絡(luò)病”論治肝纖維化也成為一個重要的方向[14]。中醫(yī)藥抗肝纖維化具有明顯優(yōu)勢[15]，對單味藥及復方的研究頗多[16-18]。軟肝散是治療肝硬化腹水的臨床經(jīng)驗方，主要由黃芪、柴胡、丹參、炙鱉甲、生牡蠣等組成，有活血化瘀、軟堅散結(jié)、疏肝益氣之效。在臨床運用多年，取得較好療效[19-20]。

以疏肝化瘀益氣法為指導的軟肝散可以緩解肝纖維化的病理改變，軟肝散可能通過下調(diào)HIF-1α、VEGF表達，抑制HIF-1α、VEGF 蛋白的過表達，調(diào)控HIF-1α/VEGF 信號通路抑制肝組織纖維化進程，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。