寇小妮，解新科，郝明霞，宋春榮，吳維

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的特點是肝脂肪堆積、炎性反應(yīng)和不同程度的纖維化[1]。NASH患者主要病理生理特點是胰島素抵抗，所以改善胰島素抵抗在預(yù)防NASH進(jìn)展方面具有治療潛力[2]。肝臟是胰島素的主要靶器官之一，在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。在肝臟中，胰島素受體底物2 (IRS-2) /磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)胰島素的糖代謝作用中起著關(guān)鍵作用[3]。胰島素受體(IR)具有2個α亞基和2個跨膜β亞基的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域，α亞基增加內(nèi)在酪氨酸激酶活性，觸發(fā)一系列磷酸化反應(yīng)，激活下游的關(guān)鍵靶點，包括IRS-2、PI3K和絲蘇氨酸蛋白激酶(Akt)[4]。大黃素是中藥大黃的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等功能[5]。大黃素可以抑制線粒體呼吸鏈活性、激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMPK)，降低肝臟能量狀態(tài)[6]。然而，大黃素作用的確切分子靶點仍不明確。既往有研究在高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗大鼠模型中檢測到了大黃素對肝糖原含量的影響[7]。然而，目前尚無大黃素對IRS-2/PI3K/Akt信號通路影響的研究。因此，本研究建立胰島素抵抗相關(guān)的大鼠NASH模型，并用大黃素進(jìn)行治療，檢測IRS-2/PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵功能分子的表達(dá)，探討大黃素防治NASH的可能作用機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雄性8周齡SD大鼠35只[由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK (甘) 2015-0005]，體質(zhì)量200～240 g，動物飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，動物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 試劑與儀器 大黃素(陜西森弗生物技術(shù)有限公司)；普通飼料、高脂飼料(普通飼料∶豬油∶蔗糖∶膽固醇∶膽鹽=83∶10∶5∶1.5∶0.5，上海斯萊克實驗動物有限公司)；血清胰島素測定試劑盒(中國原子能同位素研究所)；兔抗人IRS-2、p-IRS-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt(美國Santa Cruz公司)；兔抗體辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG二抗和兔抗β-actin單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司)；蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；ECL 超敏發(fā)光液、PVDF膜(美國 Millpore 公司)；HE染色試劑盒(中國國藥集團(tuán))；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備(德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；Au2700型全自動生化分析儀(日本Olympus公司)；凝膠成像儀(美國UVP 公司)；BIO-RAD垂直電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 分組及造模 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法選取25只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)12周制備NASH模型[8]。12周后取5只大鼠進(jìn)行稱重、檢測血糖血脂等生化學(xué)指標(biāo)及行肝組織病理檢測，以肝指數(shù)明顯增加，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血脂指標(biāo)及肝功能指標(biāo)明顯升高，肝臟病理組織學(xué)示肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)脂肪空泡，確定建立NASH模型制備成功。剩余20只大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)和大黃素組(10只)，另取同齡10只未造模大鼠作為正常對照組。大黃素組大鼠給予20 mg/kg的大黃素灌胃，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)給予8周。禁食12 h后麻醉大鼠，心臟采血，分離血清，分離肝組織并稱重，計算肝指數(shù) = 肝臟濕重/體質(zhì)量。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 空腹血糖、空腹胰島素檢測：用酶聯(lián)免疫吸附法測定空腹胰島素，操作方法按說明書進(jìn)行，并計算HOMA-IR，HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.4.2 肝功能及血脂指標(biāo)檢測：AU2700型全自動生化分析儀測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。

1.4.3 肝臟病理學(xué)檢查：取相同部位大鼠肝臟組織進(jìn)行固定，經(jīng)脫水、包埋，切成厚度為1 μm切片，用蘇木精和伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察病理變化，選出一個具有代表性的圖像。

1.4.4 蛋白表達(dá)檢測： Western-blot法檢測IRS-2、p-IRS-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量，取一塊肝組織，用生理鹽水洗滌2次，進(jìn)行研碎，根據(jù)肝組織重量加入相應(yīng)蛋白抽提試劑，進(jìn)行蛋白提取，最后進(jìn)行蛋白濃度的測定，調(diào)整蛋白濃度至相同，加入1/5體積的5×Buffer進(jìn)行變性，進(jìn)行電泳，每孔上樣量為30 μg，將印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，加入兔抗IRS-2、p-IRS-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)抗體，4℃過夜，沖洗后，將膜與辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(1∶10 000)在室溫下孵育30 min。用ECL法進(jìn)行顯色，采集圖像，以β-actin作為內(nèi)參并進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝指數(shù)、空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR水平比較 模型組大鼠肝指數(shù)、空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR水平較正常對照組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組大鼠肝指數(shù)、空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠肝功能及血脂水平比較 模型組大鼠ALT、AST、TG、TC和LDL-C水平較正常對照組增高，HDL-C水平較正常對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組大鼠ALT、AST、TG、TC和LDL-C水平較模型組降低，HDL-C水平較模型組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 各組大鼠肝組織病理學(xué)改變 正常對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝索、肝竇排列整齊，無明顯病變；模型組出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，存在炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞氣球樣變性，肝細(xì)胞索排列紊亂，小葉內(nèi)見大量炎細(xì)胞浸潤及少量點狀肝細(xì)胞壞死，部分壞死灶融合成片，未見明顯纖維化；大黃素組治療后組織脂肪變程度明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤明顯減少，見圖1。

2.4 各組大鼠肝組織中IRS-2、p-IRS-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量比較 模型組大鼠IRS-2、p-IRS-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量較正常對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組大鼠IRS-2、p-IRS-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量較模型組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖2。

3 討 論

目前，NASH已被公認(rèn)為一種重要的健康問題，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[9]。然而，NASH的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，動物模型是研究肝胰島素抵抗病理生理學(xué)的重要工具，因此提出了許多嚙齒動物模型對其進(jìn)行研究。高脂飲食模型可以重現(xiàn)人類NASH的組織病理學(xué)特征，被廣泛用于NASH的研究[10]，本研究通過高脂喂養(yǎng)大鼠12周，不僅表現(xiàn)為脂肪肝化，而且表現(xiàn)為胰島素抵抗，給予大黃素治療后，可見肝指數(shù)下降，脂肪變性明顯改善，肝組織損傷明顯減輕，同時血清ALT、AST和TG、TC、LDL-C水平降低，葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗得到了有效改善。同時，動物實驗數(shù)據(jù)顯示，大黃素可改善肝臟脂肪變性和肝臟炎性反應(yīng)，并在一定程度上改善肝纖維化[11]。這些結(jié)果與本研究的數(shù)據(jù)一致。但大黃素治療NASH的作用機(jī)制尚不清楚。

表1 各組大鼠肝指數(shù)、空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR水平比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

表2 各組大鼠肝功能和血脂水平比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05，與模型組比較,bP<0.05

表3 各組大鼠肝組織中IRS-2、p-IRS-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

正常對照組 模型組 大黃素組

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

大黃素改善胰島素抵抗的作用可能是由于IR表達(dá)和磷酸化增加及下游IRS-2/PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)導(dǎo)致的。本研究首次揭示了大黃素對IRS-2/PI3K/Akt通路的影響。在本研究的NASH和胰島素抵抗大鼠模型中，檢測到了肝臟中被抑制的IRS-2/PI3K/Akt信號通路。IRS-2、Akt和PI3K顯著降低，而大黃素處理顯著逆轉(zhuǎn)了這些分子事件。本研究中最重要的新發(fā)現(xiàn)是大黃素抑制了脂肪變性肝臟的胰島素表達(dá)。動物實驗數(shù)據(jù)顯示，大黃素可改善肝臟脂肪變性和肝臟炎性反應(yīng)，并在一定程度上改善肝纖維化[12-13]。這些結(jié)果與本研究的數(shù)據(jù)一致，胰島素抵抗引起NASH的主要原因是高胰島素血癥和脂代謝紊亂，促進(jìn)胰島素與IR的α亞基結(jié)合，誘導(dǎo)β亞基酪氨酸激酶活化，導(dǎo)致IRS-2磷酸化，從而誘發(fā)一系列生化改變[14]。IRS-2/PI3K/Akt通路在維持胰島素與其相應(yīng)IR結(jié)合的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[15]。IRS-2在肝臟和胰腺組織中大量表達(dá)，當(dāng)其表達(dá)降低時，會影響胰島素信號的有效傳遞，導(dǎo)致IR的發(fā)生[16]。PI3K過度表達(dá)抑制IR與IRS-2的結(jié)合，從而抑制PI3K 的活性[15]。大黃素可以誘導(dǎo)Neuro2a細(xì)胞中GSK-3β/ PI3K/Akt信號通路的激活[17]。在對糖尿病腎病(DN)大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路在DN早期病變的發(fā)展中起著重要作用，大黃素能顯著促進(jìn)DN大鼠p-Akt蛋白表達(dá)[18-19]。GSK-3β在胰島素受體相關(guān)信號通路中的作用受到越來越多的重視，細(xì)胞實驗涉及GSK-3β過表達(dá)阻止酪氨酸殘基進(jìn)行胰島素受體磷酸化，并減少IRS-2水平，從而削弱胰島素信號通路[20-21]。

綜上，大黃素可以改善NASH大鼠肝臟脂肪沉積及胰島素抵抗，其機(jī)制與IRS-2/PI3K/Akt信號通路激活有關(guān)，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

寇小妮：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，論文修改;解新科：實施研究過程，資料搜集整理;郝明霞：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;宋春榮：設(shè)計研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;吳維：數(shù)據(jù)收集，分析整理