孔令玉，路欣，姜玲玲

維生素K2(vitamin K2,VK2)是一種脂溶性維生素。研究已經(jīng)證明,VK2對包括肝癌在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用[1]。盡管，有關(guān)VK2抑制肝癌細(xì)胞增殖分子機(jī)制研究涉及抑制核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和信號通路等多種學(xué)說[2-5]，但仍存在有待解決的問題。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是發(fā)病率較高的腫瘤之一，其惡性程度高，致死率極高，并且具有術(shù)后預(yù)后差等特征，目前已經(jīng)成為全球第二大致死性癌癥[6-7]。近年來醫(yī)學(xué)界對于其發(fā)病機(jī)制和靶向治療的研究受到了越來越多的重視，但由于特異性基因診斷較少，而且針對于某些基因研發(fā)的靶向治療藥物效果欠佳，因此，探討肝癌的致病機(jī)制和尋找更安全有效的治療藥物具有重要的臨床意義和應(yīng)用價值。

D-雙功能蛋白(D-bifunctional protein，DBP)作為一種重要的氧化還原代謝酶，能夠促進(jìn)雌二醇(E2)脫去氫離子而失去活性，因此，生物體內(nèi)雌二醇量的改變可作為DBP活性增減的指標(biāo)。實驗研究表明，DBP在肝癌HepG2細(xì)胞明顯高表達(dá)，且能夠降低雌二醇表達(dá)水平促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[8]。而且肝癌患者中DBP的表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)具有良好的相關(guān)性，因此，DBP很有可能成為肝癌診斷和治療的新靶點[9]。最近一項研究報道，HepG2細(xì)胞內(nèi)VK2可與DBP相結(jié)合而影響其活性[10]，因此VK2很有可能通過與DBP相互作用，降低其活性，上調(diào)E2水平，來發(fā)揮其抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用[11]。因此本研究探討了VK2對DBP過表達(dá)引起的肝癌細(xì)胞增殖的抑制機(jī)制，為DBP作為肝癌診斷和治療新靶點提供了更有利的實驗依據(jù)，為VK2和DBP作為預(yù)防和治療肝細(xì)胞肝癌的分子機(jī)制提供更好的基礎(chǔ)證據(jù)和靶向治療方向，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細(xì)胞與分組：人源的肝癌細(xì)胞HepG2實驗細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院)腫瘤研究所提供。將細(xì)胞分為過表達(dá)DBP組(DBP組)和empty組及敲低DBP組(siDBP組)和siNC組，過表達(dá)DBP組和敲低DBP組分別給予0～100 μmol/L 不同濃度的維生素K2處理。

1.1.2 實驗試劑：DBP質(zhì)粒(本實驗室保存)；小干擾RNA(siRNA)，siD-雙功能蛋白(siDBP)：上游5′GUACCUUUGUAUUUGAGGAdTdT3′，下游5′UCCUCAAAUACAAAGGUACdTdT3′，siNC：上游5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3′，下游：5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT 3′(上海生物工程技術(shù)公司)；Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；兔源-抗人DBP單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔源-抗人β-actin多克隆內(nèi)參抗體(美國Santa Cruz公司)；CCK-8試劑(日本ojindo公司)；雌二醇(E2)(美國Sigma公司)；125碘(125I)雌二醇放射免疫試劑盒(天津九鼎公司)；維生素K2(北京百靈威科技公司)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞種在孔板中，于37℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長至70 %左右融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先按照轉(zhuǎn)染試劑的說明將適量的質(zhì)粒[空載體質(zhì)粒(Empty)和過表達(dá)質(zhì)粒(DBP)]、小干擾RNA[對照小干擾RNA(siNC)和目的小干擾RNA(siDBP)]分別溶于無血清無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中，混勻。將與轉(zhuǎn)染試劑同濃度的Lipofectamine 2000TM溶于無血清無抗生素RPMI1640培養(yǎng)液中，混勻，室溫靜置5 min。將上述4種轉(zhuǎn)染試劑分別與脂質(zhì)體混勻，室溫靜置20 min。最后將孔板中原有的培養(yǎng)基棄去，并用新鮮無血清無抗生素RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，將各組脂質(zhì)體和質(zhì)?；旌弦壕鶆虻稳朊靠准?xì)胞中，置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。6 h后更換為含10 % 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗。

1.3 Western-blot檢測DBP表達(dá) 處理后的細(xì)胞經(jīng)過蛋白提取、蛋白定量后用裂解液稀釋成5 μg/μl濃度的懸液，加5×上樣緩沖液95℃煮沸5 min。制作SDS-PAGE，進(jìn)行蛋白上樣和凝膠電泳，電泳后將蛋白膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，分別加兔抗人DBP和β-actin抗體(1∶1 000) 4 ℃冰箱過夜溫育，TPBS洗膜，用熒光二抗進(jìn)行室溫靜置孵育1 h (1∶5 000)，用TBST洗膜2次，每次約10 min，最后Odyssey發(fā)光儀進(jìn)行掃描。

1.4 細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測 按照說明書將CCK-8試劑與無血清的RPMI1640培養(yǎng)基以1∶4的比例混合，將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的96孔板中的培養(yǎng)基去除，每孔加入100 μl CCK-8的混合液，于37℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)4 h。最后用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值。

1.5 E2水平檢測 按照E2放射免疫試劑盒的說明，取8個試管，分別標(biāo)記為總T、NSB、S0、標(biāo)準(zhǔn)品S1、標(biāo)準(zhǔn)品S2、標(biāo)準(zhǔn)品S3、標(biāo)準(zhǔn)品S4、標(biāo)準(zhǔn)品S5，按照試劑盒說明，分別加入稀釋緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)品10、50、100、250、750 pg/ml、標(biāo)記物及抗體，充分混勻，置于37℃ 1.5 h后加入分離劑充分混勻，4℃ 3 600 r/min離心20 min，棄上清液，在γ計數(shù)儀上測定各管的放射性活度強(qiáng)度(cpm)。以cpm讀數(shù)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待測培養(yǎng)基200 μl，代替標(biāo)準(zhǔn)品，加入標(biāo)記物及抗體，充分混勻，置于37℃ 1.5 h后加入分離劑充分混勻，4℃ 3 600 r/min離心20 min，棄上清液，在γ計數(shù)儀上測得cpm值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測樣品E2的含量。結(jié)果以每毫升樣品含有E2的量 (ng/ml) 表示。

2 結(jié) 果

2.1 DBP高表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 Western-blot實驗結(jié)果顯示，DBP過表達(dá)質(zhì)粒和干擾RNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，能夠有效干預(yù)DBP的表達(dá)(圖1A、B)。CCK-8分析實驗證明，DBP過表達(dá)和敲低能相應(yīng)地增加(1.76±0.22 vs. 1.83±0.27，P<0.05)和減少(1.84±0.25 vs. 1.77±0.21，P<0.05)細(xì)胞的數(shù)量(圖1C、D)。

2.2 DBP高表達(dá)對細(xì)胞E2分泌的影響 結(jié)果顯示，DBP過表達(dá)降低了細(xì)胞E2分泌水平[(20.76±3.42)ng/ml vs.(17.23±2.65)ng/ml,P<0.05]。

2.3 維生素K2對肝癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8分析結(jié)果顯示，與對照組(Empty)相比，DBP過表達(dá)組HepG2細(xì)胞增殖加強(qiáng)(P<0.05)，當(dāng)分別給予不同濃度的VK2(0、1、10、30、50、100 μmol/L)處理48 h后，細(xì)胞的增殖呈濃度依賴性降低(P<0.05)(圖2 A)；用siRNA敲低了DBP的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖明顯降低(P<0.05)，但是VK2的處理對細(xì)胞的增殖影響不大(P>0.05)(圖2 B)。

2.4 不同濃度VK2對E2、DBP表達(dá)的影響 用不同濃度的VK2(0、20、50、100 μmol/L)處理對照組(Empty)和過表達(dá)DBP組的HepG2細(xì)胞 48 h后，檢測培養(yǎng)基中E2的水平。結(jié)果顯示，隨著VK2劑量的增加，培養(yǎng)基中E2水平也隨之增加(P<0.05)(圖3 A)。但是用100 μmol/L濃度的VK2分別處理Empty組和過表達(dá)DBP 組的HepG2細(xì)胞后，DBP蛋白表達(dá)無明顯變化(圖3 B)。

3 討 論

肝細(xì)胞癌作為致死性較高的癌癥，在全球約排在第3位，男性患病率高于女性，而觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌的發(fā)病也與地域性相關(guān)，因其預(yù)后較差，成為影響人民健康的重要威脅[12]。盡管近年來肝癌切除手術(shù)有一定的進(jìn)展，但是患者的術(shù)后生存質(zhì)量和5年生存率并不高[13]。最初發(fā)現(xiàn)VK是在血液凝固的過程中發(fā)揮作用，并且有研究報道其對骨骼健康及心血管疾病有積極作用[14]。此外，近年有相關(guān)研究表明，維生素K在腫瘤的形成和生長過程中有抑制作用，特別是VK家族中的VK2在肝細(xì)胞癌的增殖中表現(xiàn)出抑制作用[15-16]。

注：A.DBP過表達(dá)質(zhì)粒(DBP)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞Western-bolt檢測DBP表達(dá)；B.DBP干擾RNA(siDBP)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞Western-bolt檢測DBP表達(dá)；C. DBP /Empty質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后CCK-8檢測細(xì)胞增殖；D.siDBP/siNC轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后CCK-8檢測細(xì)胞增殖有報道顯示，維生素K2的類似物四烯甲萘醌不僅可以抑制肝癌的進(jìn)展，更重要的是能降低肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率[4-5]。這些研究結(jié)果表明，VK2在HCC的治療和術(shù)后康復(fù)中發(fā)揮了潛在的抗腫瘤特性。

圖1 DBP過表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖的影響

注：A. DBP過表達(dá)質(zhì)粒/空質(zhì)粒處理HepG2細(xì)胞后加入不同濃度VK2，CCK-8檢測細(xì)胞增殖；B.siDBP/siNC干擾RNA處理HepG2細(xì)胞后加入不同濃度VK2，CCK-8檢測細(xì)胞增殖

圖2 維生素K2對肝癌細(xì)胞增殖的影響

注：A. DBP過表達(dá)質(zhì)粒/空質(zhì)粒處理HepG2細(xì)胞后加入不同濃度VK2，放射免疫檢測E2水平；B.DBP過表達(dá)質(zhì)粒/空質(zhì)粒處理HepG2細(xì)胞后加入100 μmol/L VK2，Western-bolt檢測DBP表達(dá)

圖3 維生素K2對肝癌細(xì)胞中DBP活性的影響

D-雙功能蛋白(DBP)是生物組織細(xì)胞器過氧化物酶體中極其重要的一種氧化還原酶。DBP在哺乳動物的肝、心臟、腦、前列腺等組織中都有表達(dá)。更重要的是DBP可以催化雌二醇(E2)脫氫失去活性，從而產(chǎn)生雌酮[11]。以往研究也發(fā)現(xiàn)，人肝癌病理組織中DBP高表達(dá)，肝癌HepG2 細(xì)胞中DBP表達(dá)升高從而降低E2水平表達(dá)后，使促癌細(xì)胞增殖基因cyclin D1及PCNA等的表達(dá)明顯升高，而這些最終導(dǎo)致了肝癌細(xì)胞的增殖[8-9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，合成后的生物素VK2能夠與DBP相結(jié)合導(dǎo)致DBP活性降低[10]。本實驗中，VK2與DBP相互作用降低DBP的活性，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)E2的水平顯著增加，進(jìn)而起到了抑制HCC細(xì)胞增殖的重要作用。

綜上，維生素K2對肝癌細(xì)胞增殖有較好的抑制作用。VK2通過與DBP相互作用，降低了DBP的催化活性，升高了E2的表達(dá)水平，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。本研究初步闡明VK2通過DBP抑制肝癌細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制，為肝癌的診斷和術(shù)后聯(lián)合監(jiān)測提供新的思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

路欣：實施研究過程，論文撰寫和修改；孔令玉：實施部分實驗，分析實驗數(shù)據(jù)，統(tǒng)計學(xué)分析；姜玲玲：設(shè)計研究思路，論文審核