馮麗雄，彭 鶯，吳偉東，萬(wàn)恒興

(深圳技師學(xué)院 應(yīng)用生物系，廣東 深圳 518116)

頭孢曲松鈉是第三代半合成頭孢菌素類抗生素，其抗菌譜廣，抗菌原理是通過(guò)抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁合成，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌均有中等強(qiáng)度的抗菌作用[1]，在臨床中廣泛應(yīng)用[2-4]。測(cè)定頭孢曲松鈉的含量的方法主要是高效液相色譜法，但高效液相色譜法檢測(cè)樣品制備和操作步驟復(fù)雜[5-7]，檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，試劑耗材成本高，環(huán)境污染大，是現(xiàn)代企業(yè)面臨需要解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，在分析領(lǐng)域里發(fā)展迅速的近紅外光譜(Near-infrared Spectroscopy，簡(jiǎn)稱NIR)分析技術(shù)，具有測(cè)量速度快、測(cè)試成本低、無(wú)需化學(xué)試劑、樣品無(wú)需預(yù)加工等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，在化工、制藥等許多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。NIR技術(shù)已成功應(yīng)用于測(cè)定注射用頭孢派酮鈉[11]、注射用頭孢他啶[12]和注射用五水頭孢唑林鈉[13]含量近紅外定量模型的報(bào)道。本文對(duì)建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證并將該方法應(yīng)用于頭孢曲松鈉原料及成品的含量測(cè)定。

1 儀器和樣品

1.1 儀器

瑞士萬(wàn)通NIRS XDS Rapid Liquid Analyzer近紅外光譜分析儀，配單色儀400 nm至2500 nm的波長(zhǎng)；石英比色皿厚度1 mm，數(shù)據(jù)收集和處理等通過(guò)Vision軟件完成。美國(guó)Waters高效液相色譜儀，e2695四元梯度洗脫系統(tǒng)，2489雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，Waters柱溫箱，Empower2色譜工作站軟件，色譜柱為島津 ODS-3 C18(150*4.6 mm,5 μm)。XP205分析天平(感量：0.00001 g，瑞士Mettler Toledo),瑞士Mettler Toledo S20 pH計(jì)。

1.2 樣品

頭孢曲松鈉工作對(duì)照品(國(guó)藥集團(tuán)致君(深圳)制藥有限公司，批號(hào)：180601)；頭孢曲松反式異構(gòu)體對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130660-201702)；頭孢曲松鈉原料由珠海麗珠藥業(yè)有限公司和齊魯安替制藥有限公司生產(chǎn)(共25批)；注射用頭孢曲松鈉成品(國(guó)藥集團(tuán)致君(深圳)制藥有限公司生產(chǎn)共25批)。

2 方法和結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法：分別精密稱取含頭孢曲松鈉工作對(duì)照品2、1.75、1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25、0.1 g置10 mL 容量瓶中，用純化水溶解并定容至刻度，制成 200、175、150、125、100、75、50、25、10 mg，制成-1 的頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液配制方法：精密稱取頭孢曲松鈉1 g，置于10 mL容量瓶中，用純化水溶解并定容至刻度，制得100 mg制得水-1 溶液。

2.2 光譜掃描

儀器預(yù)熱30 min，并進(jìn)行性能測(cè)和波長(zhǎng)確認(rèn)，通過(guò)測(cè)試后方可檢測(cè)。光譜范圍400～2500 nm，分辨率8.75 nm，掃描次數(shù)32 次，掃描平衡時(shí)間5 s，平衡溫度30℃。

2.3 模型建立及參數(shù)選擇

圖1 對(duì)照溶液(100 mg·mL-1)近紅外光譜二階導(dǎo)迭加圖Fig.1 The overlap spectra of reference solutions (100 mg·mL-1)NIR second derivative

圖2 對(duì)照溶液(100 mg·mL-1)近紅外透射光譜圖Fig.2 The initial NIR transmission spectrum of reference solutions(100 mg·mL-1)

通過(guò)近紅外光譜儀采集16個(gè)含頭孢曲松100 mg0孢曲-1 的對(duì)照溶液，比對(duì)二階導(dǎo)迭加圖，其中：在420～1400 nm和1500～1800 nm兩個(gè)區(qū)域重疊吻合度高(見(jiàn)圖1)，具有較好的穩(wěn)定性，但在500～900 nm波段范圍內(nèi)吸收值低(接近-0.010)(見(jiàn)圖2)，故對(duì)波段420～500 nm和900～1800 nm進(jìn)行變量篩選。定量模型的評(píng)價(jià)可以通過(guò)內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證來(lái)評(píng)估，內(nèi)部驗(yàn)證主要通過(guò)“留一法”交叉驗(yàn)證[14]來(lái)評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力。相關(guān)系數(shù)(Corr.Coeff.)，預(yù)測(cè)殘差平方和(PRESS)，校正均方差(RMSEC)和預(yù)測(cè)均方差(RMSEP)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)選擇的波段模型進(jìn)行評(píng)估。相關(guān)系數(shù)R2的值介于0～1之間，值越大擬合性越好，RMSEC和RMSEP用于衡量預(yù)測(cè)值和測(cè)量值之間的平均偏差，數(shù)值越小說(shuō)明模型的穩(wěn)健性越好，PRESS越小預(yù)測(cè)能力越好[15]。建模過(guò)程中通過(guò)考察預(yù)測(cè)殘差平方和(PRESS)確定主因子數(shù)(Factor)，PRESS值越小，模型的預(yù)測(cè)能力越好[16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)人工選擇不同光譜區(qū)域建立定量模型，結(jié)果見(jiàn)表1所示。在1600～1700 nm和1700～1800 nm波段，相關(guān)系數(shù)分別為0.9997和0.9993，表明這兩個(gè)波段的模型擬合性高；校正均方差、預(yù)測(cè)殘差平方和數(shù)值均是最小的，分別是為0.2725、0.4903和0.3682、0.6362，表明這兩個(gè)波段模型的穩(wěn)健性好，故選擇1600～1800 nm波段進(jìn)行建模。當(dāng)主因子數(shù)是5時(shí)，PRESS值3.5291最小，見(jiàn)圖3，故選擇最優(yōu)因子數(shù)5；頭孢曲松鈉對(duì)照溶液在10～200 mg0對(duì)照-1范圍內(nèi)與計(jì)算濃度相關(guān)系數(shù)接近1(R2=0.9999)，見(jiàn)圖4；RMSEC(校正均方差)與RMSEP(預(yù)測(cè)均方差)數(shù)值接近，表明該模型具有較好的穩(wěn)定性。

表1 光譜區(qū)域?qū)＝Y(jié)果的影響Table 1 Influence of spectral range on the results of the model

圖3 主因子數(shù)和預(yù)測(cè)殘差平方和關(guān)系
Fig.3 Correlation of the principal factors numberto the PRESS

圖4 對(duì)照溶液濃度和計(jì)算濃度相關(guān)性(10～200 mg0液濃-1)
Fig.4 Correlation of calculated values to reference values (10～200 mg·mL-1)

2.4 定量模型的檢驗(yàn)

采用外部驗(yàn)證的方法對(duì)模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估，即用定量模型近紅外光譜法測(cè)試頭孢曲松鈉樣品(原料及成品各25批)結(jié)果與高效液相色譜法[17-18]測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算近紅外光譜法(C)與高效液相色譜法(M)的偏差(%)=(C-M)/MM差(相%。結(jié)果見(jiàn)表 2，偏差在-1.64%～1.78%內(nèi)，平均相對(duì)偏差0.87%。配對(duì)t檢驗(yàn)表明，在α=0.05 顯著性水平上，兩者無(wú)顯著性差異。證明近紅外光譜法可以用于快速預(yù)測(cè)頭孢曲松鈉含量。

表2 頭孢曲松鈉近紅外光譜PLS和HPLC 法測(cè)定結(jié)果比較Table 2 Comparison of the ceftriaxone content by NIRS PLS and HPLC

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取頭孢曲松鈉原料(批號(hào)：QS21804090)，分別制成含頭孢曲松濃度為 200、175、150、125、100、75、50、25、10 mg為含頭-1的溶液，連續(xù)5次取樣并測(cè)定其近紅外光譜，代入模型，用 PLS 法計(jì)算樣品的含量。5次平行測(cè)定的含量 RSD 結(jié)果分別為0.05%、0.06%、0.10%、0.06%、0.07%、0.19%、0.34%、0.53%和1.83%，表明精密度良好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)頭孢曲松鈉溶液近紅外光譜，最終選擇1600～1800 nm(C-H鍵一級(jí)伸縮振動(dòng)一級(jí)倍頻峰吸收區(qū))波段，采用偏最小二乘法建立近紅外定量分析模型。因?yàn)樗芤褐械囊簯B(tài)水分子締合，吸收帶的細(xì)節(jié)帶消失，形成了較寬的譜帶[19]。水分子O-H 伸縮振動(dòng)的一級(jí)倍頻在約1440 nm，合頻在 1940 nm附近有較強(qiáng)的吸收，在建模需避開(kāi)這兩個(gè)波段。

本文建立的近紅外偏最小二乘法定量模型，對(duì)照溶液濃度在10～200 mg0液濃-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)良好(0.9999)。通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行外部驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)比較，近紅外偏最小二乘法定量模型與高效液相色譜法檢測(cè)的結(jié)果基本一致，但在精密度實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)測(cè)試低濃度溶液(10 mg精密度-1，RSD=1.83%)和高濃度的溶液(200 mg0濃度-1，RSD=0.05%)RSD有差異，高濃度溶液精密度更好。

頭孢曲松鈉含量測(cè)定近紅外光譜法與高效液相色譜法相比，近紅外光譜法檢測(cè)無(wú)需對(duì)照品和特殊試劑,現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定，可以減少企業(yè)檢驗(yàn)成本，是一種環(huán)境友好型分析測(cè)試方法。