張佳瑜，徐晨悅，趙伊珂，周彥宏，金 鑫，張國紅，趙志英

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.第二臨床醫(yī)學(xué)院，2.臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，教育部血管與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017)

在生理狀態(tài)下，機(jī)體受到強(qiáng)烈的機(jī)械、化學(xué)及熱刺激后，局部組織損傷，釋放前列腺素E、組胺、羥色胺、緩激肽等致痛物質(zhì)，興奮傷害性感受器，產(chǎn)生異常動(dòng)作電位，經(jīng)由三叉神經(jīng)節(jié)或背根神經(jīng)節(jié)中的中小型神經(jīng)元感受并向中樞傳遞,引起疼痛反應(yīng)。目前的鎮(zhèn)痛藥主要包括中樞性鎮(zhèn)痛藥和非中樞性抗炎藥[1]，后者主要是非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，通過抑制花生四烯酸環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)的活性來抑制炎性介質(zhì)的分泌而發(fā)揮作用，但存在消化道潰瘍、腎臟毒性、血小板功能障礙等不良反應(yīng)，以及鎮(zhèn)痛效果較弱的特點(diǎn)。使用NSAIDs，用藥劑量達(dá)到一定水平以上時(shí)，增加藥物劑量既不能增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛作用，又明顯增加藥物的毒性反應(yīng)。因此，臨床上如果需要長期使用NSAIDs，或日用劑量已經(jīng)達(dá)到限制性用量時(shí)，應(yīng)考慮更換為阿片類鎮(zhèn)痛藥[2]，但阿片類藥物由于其成癮性等副作用限制了其臨床應(yīng)用。

通過聯(lián)合用藥可以增加主要藥物的鎮(zhèn)痛效果或減輕副作用，減少阿片類藥物的應(yīng)用。鉀離子通道在維持神經(jīng)細(xì)胞膜電位和興奮性中起重要作用，多項(xiàng)研究表明[3]，電壓門控性鉀離子通道家族(voltage dependent potassium channel，Kv)中，Kv7通道開放劑可以通過提高電壓依賴性鉀電流[voltage dependent potassium currents，IK( M)] 使膜靜息電位處于超極化狀態(tài)，降低神經(jīng)元的興奮性，阻斷疼痛信號(hào)的產(chǎn)生和神經(jīng)傳導(dǎo)，具有良好的鎮(zhèn)痛應(yīng)用前景。

目前臨床上應(yīng)用的NSAIDs主要是阿司匹林(aspirin)，醋酸扭體法和熱板法是最常見的篩選鎮(zhèn)痛藥的方法，因此，本課題組選用兩種Kv7通道開放劑氟吡汀(flupirtine)、瑞替加濱(retigabine)，通過醋酸扭體法和熱板法探究其是否能提高阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，以期為新型鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)以及不同類型鎮(zhèn)痛藥的聯(lián)合應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康小鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(冀)2018-008。

1.1.2試劑和儀器 注射用精氨酸阿司匹林，瑞陽制藥有限公司，批號(hào)：17083102；瑞替加濱，上海源葉生物科技有限公司，純度98%，批號(hào)：D17S6K3493；馬來酸氟吡汀，上海源葉生物科技有限公司，純度99%，批號(hào)：N03M9W60415；冰醋酸，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160625；生理鹽水，石家莊四藥有限公司，批號(hào)：1801203402；RCY-2熱板測痛儀，石家莊市冀星實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1扭體法 清潔級(jí)小鼠42只(♂♀兼用)，體質(zhì)量(20±2)g，隨機(jī)分成6組，即對(duì)照組、阿司匹林組(600 mg·kg-1)、氟吡汀組(20 mg·kg-1)、瑞替加濱組(20 mg·kg-1)、阿司匹林(600 mg·kg-1)+氟吡汀(20 mg·kg-1)組、阿司匹林(600 mg·kg-1)+瑞替加濱(20 mg·kg-1)組，每組7只。分組腹腔注射給藥，給藥后30min，腹腔注射冰醋酸(1.2%，10ml·kg-1)，然后觀察記錄20min內(nèi)各組扭體反應(yīng)潛伏期及扭體反應(yīng)次數(shù)。

1.2.2熱板法 清潔級(jí)小鼠，♀，體質(zhì)量(20±2)g，首先設(shè)定熱板溫度為(55 ±0.5)℃，選出痛閾在30s內(nèi)的雌鼠供實(shí)驗(yàn)使用。將48只雌鼠隨機(jī)分成6組，即對(duì)照組、阿司匹林組(600 mg·kg-1)、氟吡汀組(20 mg·kg-1)、瑞替加濱組(20 mg·kg-1)、阿司匹林(600 mg·kg-1)+氟吡汀(20 mg·kg-1)組、阿司匹林(600 mg·kg-1)+瑞替加濱(20 mg·kg-1)組。給藥前先測定各小鼠給藥前舔后足潛伏期時(shí)間，然后每組小鼠給予相應(yīng)的藥物, 給藥15、30、45、60 min分別測定小鼠舔后足潛伏期時(shí)間1次。痛閾按60s計(jì)算，對(duì)60s不舔后足的小鼠，應(yīng)立即取出。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算不同時(shí)間舔后足潛伏期延長率。舔后足潛伏期延長率/%=(給藥后各時(shí)間點(diǎn)測定的舔后足潛伏期-給藥前舔后足潛伏期)/給藥前舔后足潛伏期×100%。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響與對(duì)照組相比，阿司匹林組扭體反應(yīng)潛伏期時(shí)間明顯延長(P<0.01)，扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；氟吡汀組、瑞替加濱組扭體反應(yīng)潛伏期差異無顯著性，但扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；阿司匹林+氟吡汀組扭體反應(yīng)潛伏期時(shí)間明顯延長(P<0.05)，扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；阿司匹林+瑞替加濱組扭體反應(yīng)潛伏期時(shí)間也明顯延長(P<0.01)，扭體次數(shù)也明顯減少(P<0.01)。

與阿司匹林組相比，阿司匹林+氟吡汀組扭體反應(yīng)潛伏期無差異，但扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；阿司匹林+瑞替加濱組扭體反應(yīng)潛伏期明顯延長(P<0.01)，扭體反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。

氟吡汀組與瑞替加濱組在扭體反應(yīng)中的鎮(zhèn)痛作用未見明顯差異，但與阿司匹林+氟吡汀組相比，阿司匹林+瑞替加濱組明顯延長了扭體反應(yīng)潛伏期時(shí)間(P<0.01)。見Tab 1 。

Tab 1 Effect of turning body induced by

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsaspirin;△△P<0.01vsaspirin+flupirtine

2.2 對(duì)熱板致痛的鎮(zhèn)痛作用與對(duì)照組相比，除瑞替加濱組外，各給藥組在給藥15 min后舔后足潛伏期延長率均明顯增加(P<0.05)；第30 min、45 min和60 min，除阿司匹林+瑞替加濱組與對(duì)照組相比舔后足潛伏期延長率明顯增加外(P<0.05或P<0.01)，其余各組與對(duì)照組差異無顯著性，但存在增加趨勢(shì)。與阿司匹林組相比，除阿司匹林+氟吡汀組給藥45 min舔后足潛伏期延長率下降外，阿司匹林+氟吡汀組和阿司匹林+瑞替加濱組在其余各時(shí)間舔后足潛伏期延長率均較阿司匹林組有增加趨勢(shì)，其中阿司匹林+瑞替加濱組在30 min和60 min時(shí)與阿司匹林組差異有顯著性(P<0.05)。與阿司匹林+氟吡汀組相比，阿司匹林+瑞替加濱組在45 min和60 min舔后足潛伏期明顯延長，舔后足潛伏期延長率差異有顯著性(P<0.01，P<0.05)。見Tab 2。

3 討論

疼痛是臨床常見的癥狀之一，目前臨床上疼痛治療的藥物很多，阿司匹林是常用的藥物之一。本文通過醋酸扭體法和熱板法研究Kv7通道開放劑氟吡汀和瑞替加濱與阿司匹林的聯(lián)合應(yīng)用，為臨床疼痛治療和新型復(fù)方鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供一種新的方案。

阿司匹林是常用的NSAIDs，通過抑制體內(nèi)前列腺素的生物合成，降低前列腺素本身的致痛作用，并且降低前列腺素使末梢感受器對(duì)緩激肽等致痛因子增敏作用。但阿司匹林的胃腸道、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面的不良反應(yīng)發(fā)生率較高; 同時(shí)作為癌痛第一階梯的主要用藥，阿司匹林存在最大有效劑量，此時(shí)再增加藥物劑量并不能增強(qiáng)其止痛效果，反而使藥物的毒性反應(yīng)明顯增加，限制了其臨床應(yīng)用。

GroupIncrement percentage of latent period/%15 min30 min45 min60 minControl-26.37±4.53-19.56±8.25-4.23±10.23-16.13±19.78Aspirin3.12±12.36*-5.26±18.6624.51±30.54-7.07±20.52Flupirtine23.18±17.11*-1.76±11.5215.32±26.1415.47±17.31Retigabine-25.17±7.98-20.43±13.98-18.52±15.752.75±11.09Aspirin+Flupirtine6.68±10.96*18.29±15.86-5.58±8.33-3.96±6.86Aspirin+Retigabine25.69±17.19*73.33±22.83**#33.27±5.29△△64.77±22.89*#△

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsaspirin;△P<0.05,△△P<0.01vsaspirin+flupirtine

氟吡汀和瑞替加濱是唯一被批準(zhǔn)用于臨床的神經(jīng)元Kv7通道開放劑，近年來，氟吡汀的鎮(zhèn)痛作用已逐漸被證實(shí)，并在各種疼痛的臨床治療觀察中效果良好。另外有研究表明[4]，氟吡汀能協(xié)同增強(qiáng)嗎啡、曲馬多的鎮(zhèn)痛作用。瑞替加濱作為抗癲癇藥物已在國外上市，但研究表明瑞替加濱對(duì)神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛、內(nèi)臟性疼痛等多種疼痛具有鎮(zhèn)痛作用[5-7]。研究表明，Kv7通道在初級(jí)傳入神經(jīng)元以及丘腦和脊髓神經(jīng)元中表達(dá)。Kv7.2-5參與IK( M)的產(chǎn)生，IK(M) 通過控制動(dòng)作電位的產(chǎn)生和頻率，使細(xì)胞復(fù)極來降低周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[8]。

醋酸扭體法是最常見的篩選鎮(zhèn)痛藥的方法，簡便、敏感且重復(fù)性好，醋酸刺激引起小鼠腹膜炎癥而產(chǎn)生疼痛，表現(xiàn)為腹部收縮內(nèi)凹、臀部歪扭、腹前壁緊貼籠底和后肢伸張樣的扭體反應(yīng)。醋酸介導(dǎo)的扭體反應(yīng)可能是由腹腔pH值降低而直接刺激傷害性傳入神經(jīng)元和促進(jìn)炎癥遞質(zhì)的合成導(dǎo)致，是外周疼痛的經(jīng)典模型。本實(shí)驗(yàn)中，阿司匹林、氟吡汀和瑞替加濱都表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用，阿司匹林組扭體次數(shù)與后兩者相比無明顯差異，但更明顯延長了小鼠扭體潛伏期時(shí)間(P<0.01)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。與阿司匹林組相比，阿司匹林+瑞替加濱組的扭體潛伏期明顯延長(P<0.01)，阿司匹林+氟吡汀組和阿司匹林+瑞替加濱組扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01，P<0.01)，說明氟吡汀、瑞替加濱能增強(qiáng)阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，發(fā)揮聯(lián)合鎮(zhèn)痛作用。

熱板法[9]是利用一定強(qiáng)度的溫?zé)岽碳?dòng)物軀體的某一部位以產(chǎn)生痛反應(yīng)，以刺激開始至出現(xiàn)反應(yīng)的潛伏期為測痛指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，阿司匹林較氟吡汀和瑞替加濱并未顯示出鎮(zhèn)痛優(yōu)勢(shì)，但與阿司匹林組相比，阿司匹林+氟吡汀組的舔后足潛伏期延長率均有增加趨勢(shì)，阿司匹林+瑞替加濱組在30 min和60 min的舔后足潛伏期延長率明顯增加(P<0.05)，進(jìn)一步證明了氟吡汀、瑞替加濱能增強(qiáng)阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用。

此外，在兩組研究中，我們發(fā)現(xiàn)氟吡汀組與瑞替加濱組的鎮(zhèn)痛作用未顯示出明顯差異，但阿司匹林+瑞替加濱組卻較阿司匹林+氟吡汀組顯示出更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果。我們推測，此現(xiàn)象可能是由于氟吡汀、瑞替加濱的結(jié)構(gòu)不同，與相應(yīng)受體結(jié)合的基團(tuán)存在差異[10]，從而導(dǎo)致兩者與受體的親和力不同，使得瑞替加濱與阿司匹林聯(lián)用較氟吡汀與阿司匹林聯(lián)用顯示出更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果。有研究表明[10-11]，瑞替加濱EC50值小于氟吡汀，也支持了我們的推測。

阿片類藥物、膽堿及地塞米松與阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用的鎮(zhèn)痛作用已被證實(shí)[12-13]。本文研究表明，阿司匹林和Kv7通道開放劑氟吡汀、瑞替加濱單用有鎮(zhèn)痛作用，而當(dāng)阿司匹林和氟吡汀或瑞替加濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，氟吡汀或瑞替加濱能增強(qiáng)阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，其效果比單用阿司匹林更為明顯，這也進(jìn)一步說明聯(lián)合用藥比單一藥物鎮(zhèn)痛有更為明顯的效果。阿司匹林通過抑制體內(nèi)前列腺素的生物合成，減少了疼痛信號(hào)的產(chǎn)生，同時(shí)減少中樞COX-2表達(dá)上調(diào)以抑制中樞痛覺超敏，而氟吡汀、瑞替加濱則通過開放Kv7通道，提高了IK( M)，使膜靜息電位處于超極化狀態(tài)，降低中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性，抑制了疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)和中樞痛覺超敏。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，具有不同機(jī)制的藥物聯(lián)合應(yīng)用很可能表現(xiàn)為協(xié)同作用，而具有相似機(jī)制的藥物聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為相加作用。本實(shí)驗(yàn)中，阿司匹林和Kv7通道開放劑通過不同機(jī)制發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，故推斷兩者的相互作用可能為協(xié)同作用。

阿司匹林和Kv7通道開放劑的聯(lián)合應(yīng)用符合多模式鎮(zhèn)痛的理念，即聯(lián)合使用不同作用機(jī)制的鎮(zhèn)痛藥物，通過多種機(jī)制產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，從而獲得更好的鎮(zhèn)痛效果，降低藥物副作用。本實(shí)驗(yàn)采用小劑量阿司匹林進(jìn)行探究，聯(lián)合應(yīng)用效果與阿司匹林的劑量關(guān)系仍需進(jìn)一步探究；另外，雖然氟吡汀、瑞替加濱的副作用相對(duì)較少，但它們可能產(chǎn)生抑制平滑肌收縮[15]、肝臟毒性等不良反應(yīng)，與阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用的安全性也需進(jìn)一步驗(yàn)證。