申 威，邱德來，初春平，潘 文，金文哲

(延邊大學(xué) 1. 附屬醫(yī)院疼痛科、2.醫(yī)學(xué)部細(xì)胞功能研究中心,生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133000)

依托咪酯(etomidate，ET)是一種作用強(qiáng)、短效的非巴比妥類靜脈麻醉藥，在臨床中被廣泛使用。前期在體電生理學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)，ET降低在體小腦皮層浦肯野細(xì)胞的單純峰電位放電頻率并具有濃度依賴性，ET(300 μM)完全抑制自發(fā)性單純性放電，但自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電依然存在。ET(300 μM)不僅完全抑制自發(fā)性單純性放電，而且抑制自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電小穗數(shù)量[1]。另有研究報(bào)道，ET通過激活 GABAA和甘氨酸受體來抑制在體小鼠小腦浦肯野細(xì)胞(Purkinje cell，PC)活性[2]，而目前為止ET影響在體動(dòng)物小腦皮質(zhì)分子層感覺信息處理的機(jī)制尚不清楚。因此，我們有必要深入研究ET對(duì)烏拉坦麻醉小鼠小腦分子層中感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)的影響，為探討ET對(duì)小腦皮層功能的影響機(jī)制做好前期準(zhǔn)備。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康♂或♀ HA/ICR小鼠，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SYXK (Ji) 2011-006。在光照周期(12 h ∶12 h)中，自由獲取食物和水。

1.2 儀器美國產(chǎn)Axopatch-200B膜片鉗放大器、1440AD/DA轉(zhuǎn)換器、膜片鉗專用顯微鏡(Nikon Eclipse E-600FN, Japan)、體視顯微鏡(Nikon,日本)、Clampex10.3數(shù)據(jù)采集與分析軟件及美國Sutter公司生產(chǎn)的MP-385電動(dòng)微操縱器等。

1.3 藥物與試劑ET(批號(hào)：20140812)、SR95531、士的寧，購自Sigma-Aldrich(中國上海)。將所有化學(xué)品溶解形成溶液并保持冷凍成等分試樣,最后在含氧的人工腦脊液中以0.4ml/min的速度將它們灌流于小腦表面。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的制備參照參考文獻(xiàn)[3]的模型制備方法，經(jīng)腹腔注射烏拉坦1.3 g·kg-1施行麻醉，并植入自制氣管導(dǎo)管妥善固定，然后將小鼠置于特制的腦立體定位儀上，用雙側(cè)耳棒固定頭部，在小腦CrusⅡ小葉進(jìn)行開顱手術(shù)，開孔直徑約為1～1.5mm，將小鼠和腦立體定位儀同時(shí)固定在顯微鏡下，確定需要記錄的部位后進(jìn)行電生理記錄。

2.2 分子層場(chǎng)電位記錄參照參考文獻(xiàn)[4]的場(chǎng)電位記錄方法，使用Multi-clamp700B放大器，通過D/A轉(zhuǎn)換器1440和Clampfit10.3軟件獲取感覺刺激活動(dòng)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 ET對(duì)感覺刺激誘發(fā)小腦皮層分子層場(chǎng)電位的影響吹風(fēng)刺激(30 ms，60 psi)同側(cè)觸須墊誘發(fā)分子層產(chǎn)生正相波(P1) 和負(fù)相波(N1)。小腦表面灌流ET(50 μmol·L-1，10 min)明顯抑制 P1反應(yīng)，導(dǎo)致振幅減少(P<0.05)。ET對(duì)P1振幅的抑制作用具有明顯的濃度依賴性，最低有效濃度為10 μmol·L-1，半數(shù)抑制濃度為64.57μmol·L-1，ET濃度為500μmol·L-1時(shí)，下降至基線的98.68%。

3.2 ET對(duì)感覺刺激誘發(fā)的P1動(dòng)態(tài)特性的影響小腦表面灌流ET50 μmol·L-1，P1的半寬增加(P<0.05), P1曲線下面積明顯較小(P<0.05)，另外，ET明顯增加了P1的上升時(shí)間和衰減時(shí)間(P<0.05)。

3.3 ET對(duì)GABAA受體或甘氨酸受體被阻斷時(shí)感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)的影響小腦表面灌注GABAA受體拮抗劑SR95531(gabazine，20 μmol·L-1)阻斷感覺刺激誘發(fā)的GABA能反應(yīng)P1，并顯示刺激誘發(fā)的興奮性反應(yīng)N2。在SR95531的存在下，依托咪酯對(duì)N2的振幅沒有明顯影響(P>0.05)，N2的波形下面積與單獨(dú)給予gabazine時(shí)的波形下面積差異無顯著性(P>0.05)。這些結(jié)果表明ET通過 GABAA受體調(diào)節(jié)感覺刺激誘發(fā)小腦皮層分子層場(chǎng)電位反應(yīng)。此外，在甘氨酸受體拮抗劑士的寧(strychnine，10 μmol·L-1)存在的情況下，感覺刺激對(duì)P1振幅沒有明顯影響(P>0.05)，再灌流ET(50 μmol·L-1，10 min)，P1振幅明顯下降(P<0.05)，這與單獨(dú)給予ET相似。這些結(jié)果表明，甘氨酸受體阻斷劑無法阻斷依托咪酯誘導(dǎo)的面部刺激誘發(fā)的抑制反應(yīng)。

3.4 ET通過小腦皮層MLI抑制感覺刺激誘發(fā)的反應(yīng)ET(50μmol·L-1，)給藥10 min明顯抑制自發(fā)性峰電位和觸覺誘發(fā)峰電位，自發(fā)性、感覺誘發(fā)鋒電位的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量[(1.64±1.6)%、(21.0±6.4)%]較基線[(100.0±1.35)%、(102.0±10.07)%]降低(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明小腦表面灌注依托咪酯會(huì)抑制小腦MLI中的自發(fā)性和感覺誘發(fā)的峰電位活動(dòng)，導(dǎo)致分子層對(duì)感覺誘發(fā)抑制效應(yīng)的減弱。

4 討論

依托咪酯可直接或間接作用于GABAA受體，產(chǎn)生GABA樣的作用，或增強(qiáng)GABA與GABAA受體結(jié)合所引起的效應(yīng)，減少神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)生頻率[5]。依托咪酯顯著抑制初級(jí)感覺皮層錐體細(xì)胞電壓門控性Na+離子通道，減小Na+電流，提示依托咪酯可能通過抑制初級(jí)感覺皮層神經(jīng)元Na+離子通道，降低神經(jīng)元興奮性，影響感覺信息的整合[6]。另有研究報(bào)道，依托咪酯可抑制大鼠海馬CA1區(qū)興奮性突觸傳遞，機(jī)制可能與增強(qiáng)突觸前GABA能性抑制性回路的興奮性有關(guān)[7]。

那么，ET如何影響小腦皮層功能的呢？ET對(duì)小腦皮層PC影響的受體機(jī)制已有報(bào)道[2]，如引言中所述，ET通過激活 GABAA和甘氨酸受體來抑制在體小鼠小腦PC活性。而我們研究結(jié)果顯示，依托咪酯明顯抑制小腦分子層中感覺刺激引起的 GABA 能反應(yīng)的振幅，表明它可調(diào)節(jié) GABA 能的突觸傳遞。依托咪酯誘導(dǎo)的感覺誘發(fā) GABA 能振幅的減少可能是由于依托咪酯通過激活GABAA受體來抑制 MLIs介導(dǎo)的感覺誘發(fā)反應(yīng)，通過MLI 響應(yīng)刺激可導(dǎo)致 GABA 釋放減少。另一方面，依托咪酯誘導(dǎo)的GABA 能上升和衰減時(shí)間的延長，表明依托咪酯抑制 MLI-PC突觸內(nèi)的GABAA受體活性。實(shí)際上，通過阻斷 GABAA 受體活性，依托咪酯未能增強(qiáng)小鼠小腦皮層平行纖維到浦肯野細(xì)胞的興奮性輸入，證實(shí)依托咪酯通過調(diào)節(jié) GABAA受體調(diào)節(jié)小腦皮層分子層感覺信息處理。我們未來將進(jìn)一步研究ET對(duì)小腦皮層顆粒細(xì)胞層的影響，為進(jìn)一步探討ET麻醉作用的細(xì)胞與分子機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。