薛念宇，白金洋，陳宇，倪宏波

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163000)

隱孢子蟲病是由原生動物隱孢子蟲引起的，可以感染許多脊椎動物，包括人類[1]，呈全球分布。隱孢子蟲感染是通過口服受隱孢子蟲卵囊污染的食物、水等發(fā)生的，在攝取之后，子孢子從卵囊中釋放出來，入侵宿主胃腸道上皮細(xì)胞并經(jīng)歷無性發(fā)育。緊隨其后的是性發(fā)育階段，導(dǎo)致產(chǎn)生潛在的遺傳多樣性卵囊，這些卵囊在糞便中完全感染。卵囊也可能在從宿主脫落之前“孵化”，導(dǎo)致再次感染和寄生蟲負(fù)擔(dān)的指數(shù)增加，引發(fā)慢性感染，特別是在免疫功能低下的宿主中[2]。感染隱孢子蟲的常見癥狀是急性或慢性腹瀉[3]。目前發(fā)現(xiàn)的隱孢子蟲有40多種[4]，其中幾種是在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，檢出最多的為人隱孢子蟲(C.hominis)和微小隱孢子蟲(C.parvum)，其他較少發(fā)現(xiàn)的蟲種有火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)、貓隱孢子蟲(C.felis)、犬隱孢子蟲(C.canis)、泛在隱孢子蟲(C.ubiquitum)、兔隱孢子蟲(C.cuniculus)、鼠隱孢子蟲(C.muris)和旅者隱孢子蟲(C.viatorum)[2]。隱孢子蟲病對牲畜的生長影響明顯，且造成較大的經(jīng)濟(jì)和產(chǎn)量損失，目前尚且沒有針對隱孢子蟲有效的治療方法[5]。

目前有多種方法應(yīng)用于隱孢子蟲病的診斷，包括病原體顯微鏡檢查、改良抗酸染色法、檢測抗原和抗體的免疫學(xué)診斷方法、提取DNA進(jìn)行檢測的分子生物學(xué)方法等等。

1 病原學(xué)診斷方法

1.1 濃縮法鏡檢

使用光學(xué)顯微鏡檢測濃縮后的糞便樣本，通過檢查糞便中存在的不同化合物(如脂肪和碎屑)之間的密度差異，增加在這些樣本中發(fā)現(xiàn)寄生蟲的可能性。最常見的卵囊濃縮技術(shù)是飽和蔗糖溶液中的浮選，乙醚-福爾馬林和醋酸-福爾馬林梯度沉淀法[6]。為了更好地觀察卵囊，建議使用光場顯微鏡，在光場顯微鏡下，卵囊呈現(xiàn)半透明，通常為略帶粉紅色的結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部含有顆粒[7]。飽和蔗糖溶液(牛皮氏溶液)中的浮選是一種簡單的離心-浮選法，于1923年發(fā)展起來，目的是促進(jìn)對動物糞便中寄生蟲形式的鑒定。這項(xiàng)技術(shù)使用高密度的蔗糖溶液來促進(jìn)原生動物卵囊和球蟲卵囊的分離，同時利用離心作為促進(jìn)碎片沉降的一種方式，使寄生結(jié)構(gòu)波動，以便稍后恢復(fù)。在離心-浮選技術(shù)中，可以使用另一種溶質(zhì)，如硫酸鋅來促進(jìn)包囊和卵囊等寄生進(jìn)化形式的密度梯度和波動。

1.2 染色法鏡檢

隱孢子蟲卵囊較小，其內(nèi)、外部結(jié)構(gòu)缺乏明顯的可見性，可能會造成診斷上的混亂。許多染色技術(shù)被用來對糞便涂片進(jìn)行染色，檢測和鑒別診斷隱孢子蟲和其他糞便寄生蟲[8]?？顾崛旧?、吉姆薩染色法、金胺-酚染色法等是檢測隱孢子蟲最常用的染色方法。吉姆薩染色法是診斷隱孢子蟲卵囊的簡便染色法，卵囊可以與酵母菌區(qū)分開。卵囊染色為淡藍(lán)色，帶紅色至紫色的小體，可以準(zhǔn)確區(qū)分出來，但缺點(diǎn)是微弱的顏色對比會導(dǎo)致閱讀困難。雖然這項(xiàng)技術(shù)可能很耗時，但在重度感染中可以用低倍鏡很好地識別卵囊[9]。金胺-酚染色法是一種與抗酸染色法結(jié)合的熒光染色法，具有快速、簡便、高效等特點(diǎn)。盡管對熒光顯微鏡要求較高，但酵母菌在這種染色中不會發(fā)出熒光。金胺染色的隱孢子蟲卵囊看起來像黃色的圓盤，在黑色背景下有一個蒼白的光暈，可以有效地識別卵囊。即使糞便不進(jìn)行濃縮直接涂片，也可以很好地觀察到卵囊[10]。

2 免疫學(xué)診斷方法

免疫學(xué)方法主要用于檢測抗原或抗體，主要方法有間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫層析檢測技術(shù)(GICA)等[11，12]。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)既可測定抗原，也可以測定抗體，將已知抗原或抗體進(jìn)行包被，加入待檢物(抗原/抗體)，顯色后，通過測定吸光值進(jìn)行定性或定量的檢測方法。卵囊檢測下限為103～104個/mL，比常規(guī)鏡檢具有更高的敏感性和特異性[13]。該程序在處理前不需要對糞便樣本進(jìn)行濃縮。分光光度讀數(shù)將消除顯微鏡檢測的主觀性?？梢苑奖恪⒖焖俚貦z測大量糞便樣本，提高了結(jié)果的可靠性[14]。近些年ELISA在細(xì)菌、病毒、寄生蟲等相關(guān)疾病方面的應(yīng)用非常廣泛。

2.2 免疫層析檢測技術(shù)

免疫層析檢測技術(shù)能在10～15min內(nèi)提供結(jié)果，它被廣泛用于美國隱孢子蟲病的常規(guī)檢測[15]，國外已經(jīng)有一些檢測隱孢子蟲抗原的商品化的免疫層析檢測試紙條，例如 ImmunoCard STAT、Cryptosporidium-Strip、FASTest CRYPTO Strip、Crypto/Giardia Rapid Assay等商業(yè)化產(chǎn)品。盡管它們使用方便，但敏感性較差，假陽性率很高，導(dǎo)致許多病例誤診[16]。

2.3 組織學(xué)檢測

石蠟包埋或福爾馬林固定后組織標(biāo)本的組織學(xué)檢查可用于某些臨床情況，既可用于診斷，也可用于研究隱孢子蟲感染的生理病理方面。然而，由于其步驟繁瑣和費(fèi)用昂貴等諸多缺點(diǎn)，不適合常規(guī)診斷。

3 分子生物學(xué)診斷方法

由于傳統(tǒng)的檢測方法具有一定的不足，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)方法被廣泛應(yīng)用于隱孢子蟲的臨床檢測，其中最常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，PCR方法可以對隱孢子蟲蟲種進(jìn)行分型。

3.1 巢氏PCR(Nested PCR)

目前巢式PCR方法被廣泛用于人類和動物體內(nèi)隱孢子蟲的鑒定。事實(shí)證明，巢式PCR比直接PCR更有效，產(chǎn)生的陽性樣品更多，并提高了糞便樣本中隱孢子蟲DNA的擴(kuò)增靈敏度[17]。巢式PCR使用了兩個引物組，因此，如果DNA模板與第一個引物組存在非特異性結(jié)合，則第二個引物組不太可能會發(fā)生這種情況[12]。

3.2 PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)

PCR-RFLP技術(shù)提高了隱孢子蟲的診斷率。當(dāng)使用合適的引物和限制性內(nèi)切酶時，PCR-RFLP可以靈敏地檢測和鑒定隱孢子蟲的種類和亞型。該方法是研究隱孢子蟲基因型與表型之間的關(guān)系，以及隱孢子蟲致病機(jī)理、毒力和遺傳群體結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)的重要工具[12]。

3.3 熒光定量PCR(q PCR)

q PCR，在正常的PCR反應(yīng)體系中，加入熒光染料或者在引物中引入探針的一種診斷方法，在擴(kuò)增的同時產(chǎn)生熒光信號，通過實(shí)時監(jiān)測信號的累積對模板進(jìn)行定量。與常規(guī)PCR相比，定量PCR(q PCR)可以在很大的動態(tài)范圍內(nèi)對遺傳靶標(biāo)進(jìn)行定量。q PCR通常被認(rèn)為是檢測和計(jì)數(shù)來自不同宿主的糞便樣本中隱孢子蟲卵囊最靈敏的實(shí)驗(yàn)室方法[18]。

過去的二十年中，基于DNA的方法有了顯著的發(fā)展，成為快速檢測隱孢子蟲不可或缺的工具。通過PCR可以進(jìn)行DNA分析，通過測序可以鑒定隱孢子蟲的種類。在許多國家，它不僅被用于研究，還在常規(guī)檢測中廣泛應(yīng)用。目前沒有標(biāo)準(zhǔn)化的方案，也沒有統(tǒng)一類型的PCR，可根據(jù)實(shí)際條件和實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠磉x擇適當(dāng)?shù)姆椒?。迄今為止，還沒有隱孢子蟲病的有效治療方法，也沒有有效預(yù)防的疫苗，因此，預(yù)防及早期診斷是控制其感染的最佳方法。