張培培，楊毅，侯麗英，張曉紅，孟麗娜，沈永明

(1.天津市兒童醫(yī)院檢驗科，天津300134;2.天津中醫(yī)藥大學，天津301617)

神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)，由未分化的神經(jīng)母細胞導致，主要發(fā)生于5 歲以下兒童，占兒童惡性腫瘤的8%～10%，男性發(fā)病率略高［1］。與其他腫瘤相比，NB 惡性程度髙，早期就可能突破腫瘤包膜侵入周圍組織臟器，經(jīng)淋巴或血行發(fā)生轉(zhuǎn)移。NB 易復發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點使其成為主要的致死原因［2］。由于NB 的發(fā)病機制及病情進展個體差異較大，因此需對多學科多種診斷評價系統(tǒng)不斷進行完善，以準確評估患兒疾病情況并制訂合適的治療方案，而實驗室檢查對這一常見疾病的早期診斷、預后判斷及評估有重要意義。其中，尿兒茶酚胺及其代謝物的檢測為最經(jīng)典的實驗室診斷方法，且聯(lián)合多種腫瘤標志物指標診斷價值更高。骨髓活檢或涂片對NB 腫瘤細胞在確定病變范圍及臨床分期上有重要作用［3］。另外，隨著細胞生物學及分子生物學的迅猛發(fā)展，染色體的改變和一些具有潛在診斷價值的分子逐漸被發(fā)現(xiàn)，它們在NB 預后判斷和評估等方面有重要意義?，F(xiàn)就兒童NB 實驗診斷學的研究進展予以綜述，以期為NB 的臨床診斷提供依據(jù)。

1 腫瘤標志物檢測

1.1 兒茶酚胺及其代謝物 NB 具有合成、分泌兒茶酚胺的特點，香草扁桃酸、高香草酸是兒茶酚胺的終末代謝物，故NB 患兒早期尿中香草扁桃酸、高香草酸排出較多，其診斷特異度分別為95.1%和95.8%［4］。對于年齡較小NB 患兒留取24 h 尿比較困難，可取某一段時間的尿測定香草扁桃酸或高香草酸與尿肌酐的比值作為評價指標。肌酐是肌酸的代謝終產(chǎn)物，由腎臟排泄，人體內(nèi)源性肌酐每日生成量幾乎恒定，24 h 尿肌酐排泄量也是恒定的［5］。3-甲氧酪胺是多巴胺的甲基化產(chǎn)物，NB 患者尿中3-甲氧酪胺水平明顯升高。3-甲氧酪胺的診斷效果與多巴胺和高香草酸相似，其水平與疾病的活動度有良好的相關性，可作為腫瘤標志物用于NB 的診斷和監(jiān)測［6］。甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素分別是腎上腺素和去甲腎上腺素的中間代謝產(chǎn)物，它們在血漿中半衰期較長，血漿濃度波動較小，特異性和敏感性均優(yōu)于兒茶酚胺測定。有學者對301 例NB 患者的8 種尿兒茶酚胺代謝物(香草扁桃酸、高香草酸、3-甲氧酪胺、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素)進行研究發(fā)現(xiàn)，兒茶酚胺代謝產(chǎn)物水平升高，其中3-甲氧酪胺與NB 的分期、年齡、MYCN 擴增、1p 雜合性喪失和骨髓侵襲等特征相關，甲氧基去甲腎上腺素是最敏感的單一代謝物，其診斷靈敏度為89%，當8 種代謝物聯(lián)合使用時，診斷靈敏度達95%［7］。除尿兒茶酚胺代謝產(chǎn)物檢測外，也有學者研究了血漿中甲氧基腎上腺素、甲氧基去甲腎上腺素和3-甲氧酪胺在NB 診斷中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-甲氧酪胺和甲氧基去甲腎上腺素表現(xiàn)出良好的診斷性能，其特異度分別為100%和95.8%，靈敏度分別為88.2%和80.4%;且該研究還發(fā)現(xiàn)，血漿甲氧基去甲腎上腺素與尿甲氧基去甲腎上腺素水平呈正相關［8］。

1.2 神經(jīng)元特異性烯醇化酶 神經(jīng)元特異性烯醇化酶是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞所特有的一種酸性蛋白酶，由神經(jīng)母細胞合成，是免疫組織化學染色的重要指標。血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶是NB 的特異性負荷指標，其高水平提示預后較差，與診斷時腫瘤的最大直徑呈線性相關，可間接反映患者體內(nèi)腫瘤的代謝活躍度［9］。但其特異性相對較差，在胰島細胞瘤、甲狀腺髓樣癌、黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、小細胞肺癌、嗜鉻細胞瘤等其他腫瘤中神經(jīng)元特異性烯醇化酶也存在高表達。

1.3 嗜鉻粒蛋白A 嗜鉻粒蛋白A 廣泛存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，是一種酸性單體蛋白，在高分期和轉(zhuǎn)移性NB 中表達水平升高，其作為腫瘤標志物特異度為72%，靈敏度為96%［10］。另有學者在NB 細胞中使用敲除的方法減少嗜鉻粒蛋白A 的表達研究NB 細胞增殖和形態(tài)學的變化，結(jié)果表明嗜鉻粒蛋白A 可以維持胰島素樣生長因子分泌和細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，從而促進NB 細胞的增殖和分化［11］。因此，血漿嗜鉻粒蛋白A 可作為腫瘤發(fā)展進程的動態(tài)監(jiān)測和預后指標。

1.4 生化指標 乳酸脫氫酶作為全身腫瘤細胞負荷的一項指標，廣泛分布于肝、腎、心肌、骨骼肌、肺等多種組織、器官中，當這些組織發(fā)生病變時血清乳酸脫氫酶水平升高，但其特異性不高。血清乳酸脫氫酶可反映NB 的疾病進程，與腫瘤的體積呈正相關，可用于NB 的診斷和隨訪［12］。血清鐵蛋白是一種急性時相反應蛋白，與鐵代謝和儲存密切相關。血清鐵蛋白水平升高不僅見于鐵負荷增加，也常見于感染、風濕或惡性腫瘤。NB 細胞快速生長與增殖，其合成鐵蛋白的能力增強，故血清鐵蛋白水平明顯升高。Meany 等［13］指出，NB 患兒血清鐵蛋白水平越高，其預后越差。C 反應蛋白是由肝細胞產(chǎn)生的一種急性時相反應蛋白，有文獻報道，C 反應蛋白在腫瘤的良惡性鑒別、早期診斷、組織學特點、轉(zhuǎn)移及治療評估等方面均有重要作用［14］，可作為NB 的診斷和監(jiān)測指標［15］，但特異性較差。因此聯(lián)合檢測多種腫瘤標志物，可以提高NB 的診斷率。

2 血液學檢測

NB 細胞常通過血液或淋巴系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，NB患兒均有不同程度的貧血，表現(xiàn)為外周血全血細胞減少，多數(shù)伴有發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、骨痛等臨床癥狀。當發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移時，患兒骨髓增生程度降低，活躍或明顯活躍。NB 細胞形態(tài)及大小在不同病例中差異明顯，其胞質(zhì)豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見粉紅色細小顆粒，核圓形或橢圓形，多為單核，也有雙核或多核，片尾可見許多瘤細胞成團聚集在一起，胞質(zhì)融合，呈“菊花形團狀結(jié)構(gòu)”，顯微鏡下可見瘤細胞間有紫紅色的條索狀纖維絲狀物質(zhì)［3］，這一形態(tài)特點可作為NB與其他類型白血病的鑒別診斷依據(jù)。細胞化學染色顯示，糖原染色試驗多表達陽性，過氧化物酶染色結(jié)果多為陰性，因此骨髓細胞形態(tài)學觀察聯(lián)合細胞化學染色可提高NB 的診斷率［16］。

3 尿細胞形態(tài)學檢測

尿液涂片分析技術具有無風險、無創(chuàng)傷等優(yōu)點，僅利用患兒尿液就可做出診斷，有廣闊的應用前景。Nishikawa 等［17］首次通過尿細胞學診斷NB，取尿液標本送達病理科診斷，采用液基細胞學方法并進行巴氏染色，其余標本進行吉姆薩染色。巴氏染色標本顯示大小不同，高度聚集的小圓細胞，核深染，胞質(zhì)稀少，未見明顯菊花狀結(jié)構(gòu)或纖維基質(zhì);而吉姆薩染色標本表現(xiàn)出高核質(zhì)比的細胞黏附成團簇狀。免疫組織化學染色顯示，腫瘤細胞對嗜鉻粒蛋白A、突觸素和神經(jīng)元特異性烯醇化酶呈彌漫性強陽性，而對CD45、肌紅蛋白呈陰性，最后組織學診斷為分化不良的NB［17］。兒童尿液細胞學檢查是一種少見的惡性腫瘤檢測方法，該技術可用于病例的快速診斷。

4 細胞遺傳學檢測

NB 是一種異質(zhì)性腫瘤，可表現(xiàn)出多種不同的染色體異常，如癌基因MYCN 擴增、1p 缺失、DNA倍體分析和雜合性缺失［18］。其中，第1 號染色體短臂1p36 缺失、第17 號染色體長臂末端(17q23-qter)獲得、11q23 缺失、14q23-ter 缺失、7q 基因獲得等是比較常見的遺傳學畸變。MYCN 癌基因定位于染色體2p24，約30%的NB 中可發(fā)現(xiàn)MYCN 擴增或MYC蛋白的表達，MYCN 基因擴增與不良預后有關，其表達特征可以作為高危NB 的生物標志物［19］。有學者利用熒光原位雜交技術檢測154 例NB 患兒MYCN基因的擴增發(fā)現(xiàn)，MYCN 的表達與年齡、NB的臨床分期及分型、核分裂-核碎屑指數(shù)高低和組織學預后分組等顯著相關，而與性別無關［20］。在患兒危險因素分期中，染色體倍數(shù)分析對預后有重要的提示意義，超二倍體或三倍體預后良好，多見于嬰兒和早期NB，而近二倍體或四倍體預后欠佳［21］。

5 流式細胞免疫分型

流式細胞術是一種生物學技術，可以對異質(zhì)細胞群的逐個細胞進行快速、定量、多參數(shù)分析，目前已運用于腫瘤學、細胞生物學、免疫學、基礎醫(yī)學及臨床檢驗等領域。其中，免疫分型是使用抗體對異質(zhì)細胞群表達的抗原，即標志物進行分析，以鑒定目標細胞群的存在及比例。流式細胞免疫分型能夠及早發(fā)現(xiàn)免疫學標志物，對NB 的診斷有重要意義。NB 細胞來源于分化差的神經(jīng)節(jié)細胞，其表面有CD13、CD15、CD56、CD117 表達，而不表達CD45［22］。CD45 是白細胞的共同抗原，所有造血細胞均表達，但NB 細胞株不表達，說明其為非造血系統(tǒng)來源。CD81分布于大多數(shù)淋巴細胞、單核細胞和粒細胞表面，血小板不表達，但人類NB 細胞株表達。GD2 是NB的特異性標記，其特異性高于CD45、CD56、CD81，現(xiàn)階段應用較多。有文獻報道，靶向GD2 的嵌合抗原受體轉(zhuǎn)染人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞后，對GD2 陽性的NB 細胞具有殺傷作用［23］。因此，GD2 可作為NB 治療的一個靶點。CD44 與MYCN的擴增呈負相關，CD44 表達且無MYCN 擴增提示預后良好，而CD44 失表達提示預后差［24］。

6 分子生物學檢測

腫瘤細胞在發(fā)生發(fā)展的各個階段均可以產(chǎn)生一些具有生物活性的小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)可以被用于NB 診斷及預后的判斷。

6.1 非編碼RNA 人類基因組的30 億個堿基對中，有98.5%的核苷酸序列為非蛋白質(zhì)編碼序列，因此非編碼RNA 在很長一段時間內(nèi)被認為是生物學“噪音”。近年來，隨著生物信息學的蓬勃發(fā)展，基因芯片、二代測序及各種分子生物學實驗技術的應用，大量具有生物學功能的非編碼RNA 被發(fā)現(xiàn)，具有代表性的為微RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA［25］。miRNA 廣泛存在于真核生物體內(nèi)，其通過參與腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程而調(diào)控NB 的進程［26-27］，血中循環(huán)miRNA 對NB 的診斷具有重要提示作用。miR-483-3P 通過下調(diào)其靶基因RIO 激酶3 表達，促進NB 的增殖、侵襲和遷移，從而發(fā)揮促癌基因的作用［28］。過表達miR-497 可誘導MYCN 擴增細胞系凋亡，抑制腫瘤細胞生長，降低血管通透性。miR-497 可以靶向與細胞周期、生存和血管生成相關的多個基因，成為NB 診療的一個候選分子［29］。miR-124 在NB 中低表達，與NB 細胞的分化有密切關系［30］。let-7 基因缺失在NB 中很常見，與MYCN 擴增負相關，可作為不良預后的獨立預測因子［31］。長鏈非編碼RNA 的長度超過200 個核苷酸，其可通過基因表達的調(diào)控及表觀遺傳學等調(diào)控影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［32］。有研究表明，長鏈非編碼RNA SNHG7 在NB 細胞中高表達，它可以作為miR-653-5p 的海綿與miR-653-5p結(jié)合，調(diào)節(jié)其下游靶基因信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子2的表達，進而促進NB 細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［33］。Mazar 等［34］發(fā)現(xiàn)，MYCN 擴增和非擴增的NB 細胞系中GAS5 的表達水平均較高。體外抑制GAS5 可導致細胞增殖缺陷、凋亡和細胞周期阻滯。他們進一步分析GAS5 克隆發(fā)現(xiàn)多個剪接變異，證明GAS5 以長鏈非編碼RNA 剪接變異體的形式對NB 細胞增殖和凋亡進行調(diào)控，從而為NB 的診療提供新靶點。

6.2 酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，Trk)家族 Trk 家族是一組神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，包括TrkA、TrkB 和TrkC，其配體分別為神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素-3［18］。研究表明，Trks 家族對NB 的預后有診斷作用［35-38］。TrkA 可促進神經(jīng)元分化，其高表達與NB 腫瘤良好的生物學行為相關，TrkA 受體與MYCN 基因擴增呈負相關［35］;而TrkB 與配體結(jié)合促進NB 細胞的惡性增殖，其多表達于MYCN 基因擴增的侵襲性NB 中，是預后不良的指標［36］。有文獻報道，磷脂酰肌醇-3-激酶和促分裂原活化的蛋白激酶通路介導了TrkB/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對NB 細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲作用［37］。TrkC 與配體結(jié)合可誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡，抑制NB細胞的惡性增殖與侵襲轉(zhuǎn)移［38］。

6. 3 間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)和配對同源異型盒蛋白2B(paired-like homeobox 2B，PHOX2B) 目前，在遺傳性NB 中研究較成熟的為ALK 基因和PHOX2B［18］。ALK 被認為是NB 的易感基因，其異常主要表現(xiàn)為點突變、基因擴增及蛋白表達增加，ALK 在進展期NB 中有過表達現(xiàn)象，特別是伴MYCN 擴增時，提示預后差。有文獻報道，ALK 直接靶定MYCN 基因促進NB 的侵襲和轉(zhuǎn)移［39］，且活化的ALK 受體可以作為ALK 基因的抑制劑，應用于臨床對腫瘤的靶向治療［40］。在家族性NB 中，2.3%～6.4%的患兒發(fā)生PHOX2B基因突變，但在散發(fā)性患兒中偶見［41］。此外，進展期NB 中易檢測到PHOX2B 突變，并提示骨髓受累及預后不良［42］。PHOX2B 是NB 微小殘留疾病的標志物，肺微轉(zhuǎn)移的NB 細胞中PHOX2B 的表達水平明顯高于肺宏觀轉(zhuǎn)移細胞，在裸鼠腎上腺原位接種敲降PHOX2B 的微轉(zhuǎn)移NB 細胞發(fā)現(xiàn)，裸鼠腺體原位腫瘤明顯增大，體重增加，肺和骨髓微轉(zhuǎn)移負荷明顯增加，提示PHOX2B 具有抑制NB 轉(zhuǎn)移的作用［43］。

6.4 HuC/D Hu 家族蛋白是一種RNA 結(jié)合蛋白，又稱類胚胎致死異常視覺家族，Hu 家族包括HuB、HuC、HuD、HuR 4 個成員［44］。HuC/D 在神經(jīng)元中特異性表達，參與了神經(jīng)元分化和神經(jīng)系統(tǒng)的維持。Takemoto 等［45］評估了85 個NB 和101 個其他小圓細胞腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，在免疫組織化學中HuC/D 的免疫反應性采用總評分(TS 范圍:0 ～8)進行半定量分析，TS≥6 為陽性。除嗜鉻細胞瘤外，NB 的TS(均值7.94)明顯高于其他小圓細胞瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(P ＜0.001);且在所有NB 和嗜鉻細胞瘤中PHOX2B 均呈陽性。因此，作為一種高度敏感的診斷標志物，HuC/D 可以將NB 與其他小圓細胞瘤區(qū)分開來。此外，HuC/D 結(jié)合PHOX2B 染色對NB 具有診斷價值。

7 小 結(jié)

NB 作為兒童顱外實體性腫瘤中最常見的惡性腫瘤，其臨床表現(xiàn)多樣，易誤診漏診或診斷時已發(fā)展至晚期。因此，對NB 的早期診斷顯得尤為重要。實驗室診斷作為NB 診斷的一項輔助手段，對判斷腫瘤負荷、治療效果及預后評估具有十分重要的意義。近年來，在高科技技術的推動下，各個學科相互滲透，NB 的診療已進入分子生物學領域，許多腫瘤相關分子及信號通路的調(diào)控模式不斷被發(fā)現(xiàn)，這些基因分子預測指標成為NB 診斷研究的新熱點，并為未來基因的靶向治療提供重要依據(jù)。