孫建東，陶臻

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院感染科,南京 210006)

近年來，手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的發(fā)病率和死亡率一直居中國C類傳染病的首位[1]，2018年其發(fā)病例數(shù)高達(dá)200萬，其中有35人死亡[2]。嬰幼兒HFMD是一種自限性疾病，通常以發(fā)熱，手、足、口、臀部的皮疹等癥狀為主。與柯薩奇病毒相比，腸道病毒71型(enterovirus A71，EV-A71)引起的HFMD更易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、循環(huán)系統(tǒng)衰竭及急性肺損傷等，甚至死亡[3]。EV-A71是一種微小病毒科腸病毒屬病毒，其基因組是一種單鏈正義RNA。EV-A71首先與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并在內(nèi)體中脫殼。病毒RNA進(jìn)行依賴內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的翻譯啟動合成，且多聚蛋白被2A和3C蛋白酶切割成結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。然后將正義病毒RNA裝入衣殼，最后成熟為感染性病毒顆粒。2018年，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《手足口病診療指南(2018版)》指出，α干擾素、利巴韋林的早期使用有一定的抗病毒療效，但目前臨床仍缺乏治療EV-A71感染的有效手段[4-5]。雖然已有3家中國公司的EV-A71 疫苗獲批上市[6]，為預(yù)防HFMD提供了有效手段，但市場上仍沒有特效的抗EV-A71藥物[7]。EV-A71疫苗因尚未納入國家免疫計劃難以推廣普及，尤其是在一些農(nóng)村地區(qū)可接受性和覆蓋率更低[8]，這為EV-A71感染的防治帶來更多困難與挑戰(zhàn)。隨著對EV-A71感染研究的深入，針對EV-A71生命周期靶點(diǎn)的抗病毒藥物已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。與病毒復(fù)制周期密切相關(guān)的功能蛋白均可以作為抗EV-A71 藥物開發(fā)的靶點(diǎn)[7]。現(xiàn)就EV-A71抗病毒藥物的最新研究進(jìn)展予以綜述。

1 針對病毒附著和進(jìn)入的藥物

識別特異性受體并與之相互作用的能力是決定病毒宿主范圍和組織嗜性的因素之一。由于病毒感染宿主細(xì)胞的第一步是與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，因此阻止該事件的抑制劑可以作為潛在的治療藥物。EV-A71附著于易感細(xì)胞后，介導(dǎo)病毒穿入細(xì)胞內(nèi)的受體，包括人類清道夫受體B2、P選擇素受體1、唾液酸化糖蛋白、硫酸乙酰肝素、核蛋白、膜聯(lián)蛋白Ⅱ、波形蛋白及熱激蛋白70等。

5H7是一種新型抗VP3的單克隆抗體。在人類清道夫受體B2的競爭性拉下實(shí)驗(yàn)中，5H7阻斷EV-A71上的受體結(jié)合位點(diǎn)以進(jìn)行病毒中和[9]。人鼠嵌合5H7的被動免疫100%保護(hù)2周齡AG129小鼠免受EV-A71 B4菌株的致死性攻擊[9]。VP3單克隆抗體5H7是一種特異性抗病毒藥物，可用于急性感染患者的被動免疫，因此可用于預(yù)防性和治療性治療。另外，病毒受體的單克隆抗體也可以通過其他機(jī)制降低EV-A71感染率。人類清道夫受體B2不僅介導(dǎo)EV-A71與宿主細(xì)胞的結(jié)合，還參與病毒感染的內(nèi)吞作用和脫殼作用。Zhang等[10]合成了抗人類清道夫受體B2的單克隆抗體JL2，其至少可通過兩種可能的方式阻斷EV-A71感染：①JL2與EV-A71競爭結(jié)合人類清道夫受體B2；②JL2可以在中性pH值下穩(wěn)定人類清道夫受體B2結(jié)構(gòu)，并防止EV-A71脫殼。但在EV-A71病毒載量較高時，受體阻斷劑不能很好地中和病毒，這可能與細(xì)胞表面存在多種EV-A71受體有關(guān)。

此外，還可以通過合成病毒受體類似物抑制EV-A71的感染。EV-A71病毒受體硫酸乙酰肝素是一種帶負(fù)電荷的線性多糖，它可以與核心蛋白共價結(jié)合形成硫酸乙酰肝素蛋白多糖。硫酸乙酰肝素蛋白多糖是細(xì)胞外基質(zhì)的主要功能成分，參與一系列的生物過程。Earley等[11]開發(fā)出了硫酸乙酰肝素類似物，它是EV-A71病毒感染的有效小分子抑制劑，與病毒衣殼結(jié)合，作為誘餌受體來阻止病毒復(fù)制。在EV-A71體外感染實(shí)驗(yàn)中，硫酸乙酰肝素類似物22的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)值為7.9 μmol/L[11]。硫酸乙酰肝素類似物22通過抑制病毒-細(xì)胞相互作用的早期階段來阻止EV-A71感染，表明該類受體類似物可與病毒衣殼蛋白結(jié)合，從而競爭性抑制病毒與細(xì)胞受體結(jié)合。因此，病毒受體類似物可能是一種新的輔助治療EV-A71感染的潛在藥物，但其也存在抗病毒效果差的問題。

2 針對病毒脫殼的藥物

EV-A71衣殼蛋白由基因組的P1區(qū)編碼，衣殼顆粒包含60個拷貝的4個P1區(qū)編碼的多肽：VP1～VP4。其中，前3個病毒衣殼蛋白(VP1～VP3)位于病毒的外表面，而較短的衣殼蛋白VP4完全位于衣殼的內(nèi)表面。衣殼蛋白通過結(jié)合宿主膜上的受體來介導(dǎo)病毒感染的開始。病毒受體N端結(jié)構(gòu)域D1與衣殼蛋白上保守氨基酸殘基結(jié)合，觸發(fā)EV-A71的不穩(wěn)定和脫殼。脫殼抑制劑作用的機(jī)制為與VP1疏水口袋緊密結(jié)合，穩(wěn)定衣殼結(jié)構(gòu)，從而阻斷病毒脫殼。病毒衣殼蛋白VP1是一個抗病毒靶點(diǎn)，因?yàn)樗缓线m的化合物占據(jù)可以穩(wěn)定病毒的衣殼，從而防止病毒脫殼后RNA釋放。

WIN系列化合物是一類重要的衣殼結(jié)合劑，它可與EV-A71衣殼蛋白VP1特異性結(jié)合。普可那利是其中一種病毒衣殼結(jié)合劑，其雖具有良好的抗病毒效果，但對普可那利自然耐藥的病毒已有報道。耐藥性問題可能使衣殼結(jié)合劑在臨床的應(yīng)用受到限制。有學(xué)者利用WIN系列化合物的骨架作為模板，發(fā)現(xiàn)了一系列新的咪唑烷酮衍生物，這些咪唑烷酮衍生物對EV-A71具有更顯著的抗病毒活性[7]。其中最有前景的咪唑烷酮化合物14對EV-A71表現(xiàn)出良好的抗病毒活性(半數(shù)效應(yīng)濃度值為4×10-3μmol/L)，并在感染EV-A71的小鼠模型中顯示出良好療效[7]。此外，有研究人員用WIN 51711衣殼蛋白抑制劑研究了EV-A71的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)抑制劑取代了VP1衣殼結(jié)合疏水口袋內(nèi)的天然口袋因子而不改變衣殼的結(jié)構(gòu)[12-13]。與WIN 51711、ALD和NLD等咪唑烷酮衍生物的作用機(jī)制相同，迷迭香酸與VP1衣殼疏水口袋結(jié)合，其與芳香族氨基酸Phe135、Phe155通過疏水作用在VP1衣殼中相互作用[14]。迷迭香酸在EV-A71感染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞早期表現(xiàn)出強(qiáng)烈的保護(hù)作用，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為1時,IC50低至(4.33±0.18) μmol/L，治療指數(shù)高至340。迷迭香酸不僅可以保護(hù)細(xì)胞不受EV-A71誘導(dǎo)的細(xì)胞病變影響，還可以保護(hù)細(xì)胞不受EV-A71誘導(dǎo)的凋亡影響。以上研究表明，結(jié)構(gòu)分析可能成為抗EV-A71衣殼結(jié)合藥物發(fā)展的新思路。

3 針對病毒多聚蛋白的藥物

EV-A71的基因組編碼11種蛋白質(zhì)，包括4種病毒衣殼蛋白(VP1～VP4)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C和3A～3D)。在這些病毒蛋白中，EV-A71 2A蛋白酶和EV-A71 3C蛋白酶已被證實(shí)在病毒-宿主相互作用和EV-A71發(fā)病機(jī)制中起重要作用[15-16]。因此，參與多聚蛋白加工及病毒復(fù)制的蛋白酶成為抗EV-A71 藥物研究的焦點(diǎn)。

EV-A71 3C蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，除EV-A71 2A蛋白酶對VP1/2A和3C/3D的切割外，它幾乎參與EV-A71多聚蛋白的所有裂解過程。EV-A71 3C蛋白酶是形成各種多聚蛋白的關(guān)鍵酶，它被認(rèn)為是研發(fā)HFMD藥物的一個關(guān)鍵靶點(diǎn)。目前已報道了多種針對EV-A71 3C蛋白酶的抑制劑，包括底物類藥物、黃酮類化合物、α-酮酰胺類化合物等。

雖然底物基肽擬合物蘆平曲韋被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗EV-A71 3C蛋白酶活性(IC50值為2.3 μmol/L)，但由于生物利用度低，蘆平曲韋沒有通過Ⅱ期臨床試驗(yàn)[17-18]。DC07090是一種新型的非基肽小分子抑制劑，其抗病毒效果較好[IC50值為(21.72±0.95) μmol/L]，且無明顯毒性[50%細(xì)胞毒性濃度(50% cytotoxic concentration，CC50)>200 μmol/L][19]。此外，DC07090也可抑制柯薩奇病毒復(fù)制，可用于進(jìn)一步開發(fā)針對EV-A71或其他小核糖核酸病毒的抗病毒治療，但需注意其生物利用度的問題。

與黃酮類化合物蘆丁的作用相似，黃體苷以劑量依賴方式(IC50為3.6×102μmol/L)阻斷EV-A713C蛋白酶活性[20]。有研究首次評估了多種黃酮類化合物在新生小鼠體內(nèi)的抗EV-A71活性，黃酮類化合物顯示出較大的抗病毒活性，其中異鼠漢素對小鼠的生存保護(hù)作用最強(qiáng)，在10 mg/kg的劑量下可提供100%的保護(hù)[21]。但黃酮類化合物的具體作用機(jī)制和安全性問題仍有待進(jìn)一步探索。

Zeng等[18]合成了EV-A71 3C蛋白酶抑制劑α-酮酰胺衍生物，并對其生化活性和抗病毒活性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，抑制劑8v、8w、8x是最佳的α-酮酰胺抑制劑[IC50值分別為(1.32±0.26) μmol/L、(1.88±0.35) μmol/L和(1.52±0.31) μmol/L]。在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，所有α-酮酰胺抑制劑均表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性(CC50>100 μmol/L)[18]。此外，Wang等[22]報道了一種高度特異性的α-羥基腈衍生物NK-1.9k，它對EV-A71 3C蛋白酶的選擇性顯著高于其他絲氨酸蛋白酶。他們在基于細(xì)胞的病毒增殖實(shí)驗(yàn)中觀察到NK-1.9k的抗病毒活性[半數(shù)效應(yīng)濃度為(37.0±0.1)×10-3μmol/L]，且具有低細(xì)胞毒性(CC50>200 μmol/L)。雖然病毒蛋白酶因其底物特異性被認(rèn)為是可能的靶點(diǎn)，但大多數(shù)藥物處在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究階段，還需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證。

4 針對病毒復(fù)制的藥物

在EV-A71 RNA復(fù)制過程中，病毒3D蛋白作為一種RNA依賴的RNA聚合酶，在胞質(zhì)中合成互補(bǔ)負(fù)鏈。RNA合成發(fā)生在病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞膜小泡外表面的復(fù)制復(fù)合體中。新合成RNA從復(fù)制復(fù)合體中釋放出來，可能進(jìn)入另一輪的翻譯和復(fù)制，或通過衣殼蛋白包裹產(chǎn)生子代病毒。因此，調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的信號通路，參與病毒復(fù)制的核酸及功能蛋白等可作為抗病毒藥物作用的靶點(diǎn)。

p38激酶的激活促進(jìn)EV-A71的復(fù)制，抑制p38促分裂原活化的蛋白激酶通路可抑制EV-A71翻譯。PD169316作為一種p38抑制劑，可高度抑制EV-A71的復(fù)制和細(xì)胞凋亡。在哺乳小鼠模型中，PD169316可通過抑制病毒復(fù)制、組織損傷和炎癥細(xì)胞因子分泌，有效治療EV-A71感染[23]。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)，在EV-A71病毒附著后，駱駝蓬堿通過抑制核因子κB信號通路抑制EV-A71復(fù)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，駱駝蓬堿體外阻止EV-A71感染的半數(shù)效應(yīng)濃度值為20 μmol/L，CC50為500 μmol/L[24]。此外，駱駝蓬堿還可保護(hù)AG129小鼠對抗EV-A71體內(nèi)復(fù)制。雖然EV-A71有不同的基因型，但通過抑制病毒復(fù)制的信號通路可以減少耐藥和失效的發(fā)生，這為抗EV-A71藥物的成功研制提供了新方向。

微RNA(microRNA，miRNA)是一種高度保守的非編碼單鏈RNA，長度通常為19～25個核苷酸。這些RNA主要通過與靶信使RNA上的互補(bǔ)序列結(jié)合來調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)它們的翻譯或穩(wěn)定性[25]。miRNA不僅在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，還參與病毒復(fù)制的調(diào)控。miR-2911是一種金銀花非典型miRNA[26]。金銀花編碼的miR-2911通過靶向VP1基因抑制EV-A71復(fù)制[27]。而另一實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p通過靶向核因子κB通路抑制EV-A71復(fù)制[28]。miRNA的抗病毒機(jī)制為抑制病毒復(fù)制相關(guān)信號通路，但因RNA結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，故使其在應(yīng)用中受限。

A3G是一種干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白，可抑制多種病毒的復(fù)制。A3G通過病毒DNA胞苷脫氨作用抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制，從而導(dǎo)致病毒基因組的G-to-A超突變，或僅以脫氨酶活性的方式破壞逆轉(zhuǎn)錄或基因組包膜[29]。對于EV-A71，A3G是一種機(jī)體固有的抗病毒因子，EV-A71非結(jié)構(gòu)蛋白2C通過自噬-溶酶體途徑誘導(dǎo)A3G降解，從而克服A3G對病毒復(fù)制的抑制[30]。Wang等[31]證明了A3G可以通過RNA依賴的RNA聚合酶和病毒RNA相互作用，并被包裝成子代病毒粒子，以降低其傳染性。這些發(fā)現(xiàn)為減少EV-A71的傳播提供了新方法。

此外，還有一些治療其他疾病的藥物對EV-A71也具有抗病毒活性。米卡芬凈是食品藥品管理局批準(zhǔn)的一種棘白菌素抗真菌藥物，其主要用于治療念珠菌感染相關(guān)疾病。研究發(fā)現(xiàn)，米卡芬凈能有效抑制EV-A71的增殖，并以較低的IC50(5 μmol/L)抑制細(xì)胞中EV-A71復(fù)制子的復(fù)制[32]。米卡芬凈對EV-A71復(fù)制子的強(qiáng)抗病毒作用和根據(jù)時間點(diǎn)添加藥物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在EV-A71感染期間，米卡芬凈作用于非病毒粒子的胞內(nèi)過程[32]。這項研究揭示了米卡芬凈作為EV-A71有效抑制劑的新適應(yīng)證，為成功研制抗EV-A71藥物提供了更快的途徑。

5 針對病毒裝配與釋放的藥物

目前，針對EV-A71裝配與釋放的藥物研究較少，但胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和子代病毒釋放也可作為EV-A71 的抗病毒靶點(diǎn)。Retro-2cycl和Retro-2.1是專門針對細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)病原體的抑制劑，它們參與包括子代病毒釋放在內(nèi)的EV-A71的生命周期過程[33]。有文獻(xiàn)報道Retro-2cycl和Retro-2.1在細(xì)胞病變效應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)中，分別以12.56 μmol/L和0.05 μmol/L的50%有效濃度抑制EV-A71感染，且細(xì)胞毒性較低(CC50分別為500 μmol/L和267.80 μmol/L)[34]。其中，10 mg/kg的Retro-2cycl的保護(hù)效果最好，每日1次，連續(xù)7 d，新生小鼠的存活率為90%(EV-A71對照小鼠的存活率為10%)[34]。Retro-2cycl和Retro-2.1通過抑制子代病毒的釋放，對EV-A71具有抗病毒作用。該研究首次確定了子代病毒釋放和胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸可以作為EV-A71的抗病毒靶點(diǎn)，但還需進(jìn)一步臨床研究。

6 其他抗病毒藥物

近年來，中草藥被廣泛應(yīng)用于病毒感染性疾病，許多中草藥在體外均具有抗病毒活性。臨床研究已證實(shí)中草藥在EV-A71感染中的抗病毒作用，如喜炎平[35]、黃芩[36]、升麻和紫草[37]等。在臨床治療的基礎(chǔ)上，眾多學(xué)者致力于研究中藥抗EV-A71的有效成分及其有效成分與病毒的相互作用機(jī)制，如艾蒿[38]、荊芥[39]、駱駝蓬[24]等。雖然中藥的抗病毒療效值得肯定，但其主要有效成分抗病毒的具體機(jī)制仍不清楚，不同成分之間的相互作用也需進(jìn)一步闡明。

7 小 結(jié)

EV-A71是繼脊髓灰質(zhì)炎被基本消滅后的另一種重要嗜神經(jīng)病毒[40]。目前，針對EV-A71復(fù)制周期的藥物研發(fā)大多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，尚無特效抗EV-A71藥物應(yīng)用于臨床?？共《舅幬锏淖饔脵C(jī)制復(fù)雜，EV-A71感染會觸發(fā)相互作用的信號通路，導(dǎo)致宿主免疫逃避和炎癥反應(yīng)[16]。抑制這些反應(yīng)和通路可發(fā)揮抗病毒效果，故對EV-A71感染引起的炎癥反應(yīng)及其信號通路的深入研究能為HFMD的治療提供新選擇[15，41]。雖然聯(lián)合用藥可以增加抗病毒活性，但EV-A71基因組對于病毒復(fù)制無校對活性RNA。因此，在病毒復(fù)制過程中經(jīng)常發(fā)生突變，導(dǎo)致許多變異和抗藥突變株的產(chǎn)生，這使得EV-A71抗病毒藥與疫苗的研發(fā)更加復(fù)雜和困難。雖然中國已經(jīng)批準(zhǔn)了兩種EV-A71滅活疫苗[21,42]，但由于沒有具體的臨床治療方法，抗病毒藥物的開發(fā)仍非常緊迫。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，治療其他疾病的臨床用藥，如米卡凈芬[32]和米諾環(huán)素[43]等具有抗EV-A71活性，這為成功治療HFMD帶來了希望。未來，相信抗病毒藥物與有效疫苗的結(jié)合將加速EV-A71的根除。