(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，山東 青島 266003； 2 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科)

兒童急性下呼吸道感染是兒科患兒常見感染性疾病,占兒科門診患兒的39.0%～65.5%，占住院患兒的24.5%～65.2%[1]，該病也是發(fā)展中國(guó)家兒童的主要死亡原因之一[2]。其中病原學(xué)是診斷的難點(diǎn)，也是影響患兒治療以及預(yù)后的主要因素，究其原因，一是標(biāo)本來源困難，二是細(xì)菌學(xué)檢測(cè)手段相對(duì)落后。近年來，內(nèi)鏡技術(shù)在臨床上對(duì)疾病的診斷與治療過程中應(yīng)用越來越廣泛，其中下呼吸道感染患兒，利用纖維支氣管鏡檢查，可在鏡下直接觀察局部病變情況，通過無菌操作采集下呼吸道分泌物進(jìn)行病原體檢測(cè)，對(duì)下呼吸道感染診斷具有較高診斷的敏感度和特異度[3]。支氣管異物是兒科常見的呼吸系統(tǒng)急重癥, 外源性物體經(jīng)口或鼻誤吸入氣管、支氣管內(nèi)而致病，甚至引發(fā)肺部感染[4]。本研究選取支氣管異物并下呼吸道感染的78例患兒的下呼吸道分泌物，同時(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)和多重PCR檢測(cè)，評(píng)價(jià)患兒致病菌的特點(diǎn)和多重PCR在下呼吸道病原菌感染診斷中的價(jià)值。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2009年10月—2015年6月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院就診并經(jīng)纖維支氣管鏡確診為支氣管異物患兒78例，其中男48例，女30例；年齡11月～11歲。患兒支氣管異物滯留時(shí)間5～30 d，所有患兒均有發(fā)熱，57例外周血白細(xì)胞升高，31例C-反應(yīng)蛋白(CRP)升高。所有患兒進(jìn)行纖維支氣管鏡檢查前均行胸部X線檢查或CT掃描，證實(shí)或懷疑有支氣管異物存在，其中23例有影像學(xué)感染證據(jù)。纖維支氣管鏡檢查時(shí)56例可見黏膜紅腫，37例可見肉芽形成，26例可見明顯黃白色膿痰，均提示存在下呼吸道感染。

1.2 標(biāo)本采集與檢測(cè)方法

所有確診患兒均于全身麻醉下行纖維支氣管鏡下支氣管異物取出術(shù)，術(shù)中應(yīng)用一次性無菌痰杯收集下呼吸道的分泌物標(biāo)本。標(biāo)本的分離培養(yǎng)方法：30 min內(nèi)將標(biāo)本分別接種到革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌的培養(yǎng)基上，用接種環(huán)鋪滿90 mm平皿，置于35 ℃恒溫培育箱18～72 h，每18 h進(jìn)行一次細(xì)菌群體和個(gè)體形態(tài)特征的觀察，72 h后菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)，嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。多重PCR檢測(cè)方法：根據(jù)我國(guó)社區(qū)獲得性肺炎常見病原譜[5]確定待檢病原菌種(肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌)，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行操作[6-8]。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，多重PCR檢測(cè)時(shí)DNA提取分裝為2管,進(jìn)行2次檢測(cè)；并且在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)立肺炎鏈球菌菌種的陽性對(duì)照及空白陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用校正Personχ2檢驗(yàn)對(duì)兩種方法病原菌檢出率進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

78例患兒下呼吸道分泌物標(biāo)本中分離培養(yǎng)檢出金黃色葡萄球菌10株，肺炎克雷伯菌6株，成團(tuán)泛菌3株，病原菌檢出率為24.3%。多重PCR檢測(cè)出流感嗜血桿菌39株，肺炎鏈球菌24株，金黃色葡萄球菌15株，肺炎克雷伯菌7株，病原菌檢出率為96.2%。75例檢出細(xì)菌的患兒中有3例同時(shí)檢出3種細(xì)菌,2例同時(shí)檢出2種細(xì)菌。應(yīng)用校正Personχ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩種方法病原菌檢出率比較差異有顯著性(χ2=6.218，P<0.05)。

3 討 論

支氣管異物是兒童時(shí)期常見急危疾病之一，是導(dǎo)致3歲以下兒童急性死亡的重要原因之一[9]。兒童由于臼齒未萌出、咀嚼功能差、咳反射不健全等原因，極易發(fā)生異物吸入。較長(zhǎng)時(shí)間的異物嵌頓會(huì)出現(xiàn)支氣管黏膜充血、肉芽組織生成、炎性分泌物增多的癥狀；另外異物本身不潔以及花生、瓜子等富含不飽和脂肪酸的異物對(duì)支氣管黏膜造成刺激，極易并發(fā)下呼吸道感染[10-12]。本研究中分離培養(yǎng)的病原菌檢出率較低，僅為24.4%，其中包括可能污染的成團(tuán)泛菌，因此需要更為準(zhǔn)確的病原學(xué)檢測(cè)方法。

常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)之所以檢出率較低，考慮與標(biāo)本質(zhì)量、抗生素使用、培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)周期等因素的影響有關(guān)。本研究中收集的支氣管異物患兒下呼吸道分泌物標(biāo)本，較多患兒異物嵌頓時(shí)間較長(zhǎng)，有肉芽組織生成，鉗取異物時(shí)易出血，部分標(biāo)本混有血液，血液中的吞噬細(xì)胞可能吞噬細(xì)菌。術(shù)前給予患兒吸入的局麻藥以及潤(rùn)滑纖支鏡的潤(rùn)滑劑也易混入標(biāo)本中，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間作用后，也可能會(huì)對(duì)培養(yǎng)結(jié)果造成一定影響[13]。有研究表明，抗生素可明顯降低血液細(xì)菌培養(yǎng)的檢出率[14-15]，本研究78例患兒僅2例術(shù)前未使用抗生素，不合理應(yīng)用抗生素也是分離培養(yǎng)病原菌檢出率低的一個(gè)重要原因。

近10余年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子、基因水平診斷致病菌已成為病原學(xué)診斷的研究方向和熱點(diǎn)。目前常用的分子生物學(xué)診斷方法有PCR、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性和探針雜交法等。單重PCR一次只能檢出一種病原，隨著臨床上對(duì)病原菌混合感染的診斷及鑒別診斷的要求日益急迫,出現(xiàn)了多重PCR檢測(cè)方法。有研究設(shè)計(jì)了同時(shí)檢測(cè)痰液、鼻咽抽吸物、肺泡灌洗液中肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體和肺炎衣原體的多重PCR體系,實(shí)現(xiàn)了以上四種病原體的同時(shí)檢測(cè)；并以分離培養(yǎng)和咽漱液PCR為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)該反應(yīng)體系對(duì)待檢菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，可以為患者的抗生素治療提供參考[16-17]。本研究結(jié)果顯示多重PCR的病原菌檢出率明顯高于分離培養(yǎng)的病原菌檢出率，兩者差異有顯著性；且75例檢出細(xì)菌的患兒中有3例同時(shí)檢出3種細(xì)菌,2例同時(shí)檢出2種細(xì)菌，提示多重PCR可檢測(cè)出混合感染的病原菌。與先前的研究結(jié)果一致[18-19]。相較于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，多重PCR可在單次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)出多種病原菌，有助于細(xì)菌混合感染的鑒別診斷；另外傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)時(shí)間需約3～7 d，而多重PCR幾小時(shí)即可出結(jié)果，縮短了檢測(cè)時(shí)間，有助于早期診斷和及時(shí)治療[20]。但多重PCR也存在一定的缺點(diǎn)：如該檢測(cè)方法以分子生物學(xué)基因擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，無法實(shí)現(xiàn)藥物敏感性試驗(yàn)，而且該反應(yīng)體系對(duì)不同特異性片段的擴(kuò)增效率會(huì)隨不同設(shè)定條件而改變，另外對(duì)試驗(yàn)操作要求也比較嚴(yán)苛[21]。

綜上所述，本研究表明支氣管異物患兒易合并流感嗜血桿菌及肺炎鏈球菌感染，在對(duì)兒童下呼吸道感染病原菌的診斷中，與細(xì)菌分離培養(yǎng)相比，多重PCR更為快速、高效、準(zhǔn)確，有助于混合感染的鑒別診斷，為選擇合適的抗感染藥物提供參考，有效避免抗生素濫用，對(duì)早期診斷及治療具有重要意義。