張瑩， 金愛， 王旭東

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

三陰乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)主要特征是α-雌激素、黃體酮和人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)表現(xiàn)均為陰性，具有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率高、腫瘤侵襲能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于非TNBC的特點，因此TNBC患者存活率和無病生存率更低，嚴(yán)重危害全世界女性的生命健康[1-3]。腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、促血管新生等是腫瘤發(fā)生發(fā)展，甚至是惡性增殖的重要原因[4-6]。因此，正確預(yù)防腫瘤細(xì)胞的惡性行為學(xué)效應(yīng)，是提升乳腺癌患者存活率的重要措施[7-8]。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)是由53個氨基酸殘基組成的低分子肽鏈，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲活動、與多種癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)，如肝癌、胃癌及乳腺癌等[9-10]。鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP)是一種降解蛋白的酶，其活性易受到肌肉中Ca2+濃度的影響[11]。有報道認(rèn)為，EGF通過CANP介導(dǎo)多種癌癥細(xì)胞的周期蛋白水解及癌細(xì)胞遷移[12]。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein ,YAP)是Hippo信號傳導(dǎo)途徑的主要下游因子，參與器官生長及組織修復(fù)，在癌癥中被廣泛激活，YAP的過表達(dá)可以刺激腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[13-15]。然而EGF促進(jìn)TNBC細(xì)胞遷移、侵襲是否與CANP-YAP信號通路有關(guān)，目前未見報道。因此，本研究通過細(xì)胞分子生物學(xué)手段，探討EGF對TNBC細(xì)胞遷移、侵襲的生物學(xué)行為及CANP-YAP信號通路的介導(dǎo)作用，力圖為探尋TNBC的臨床有效治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人源乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫，人源乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，EGF購自美國PeproTech公司，鈣蛋白酶抑制劑(calpeptin，Cal)和鈣蛋白酶抑制劑Ⅲ(calpain inhibitor Ⅲ，CI Ⅲ)購自美國Sigma公司，YAP 抗體購自美國CST公司，蛋白內(nèi)參(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司， BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo scientific公司，全細(xì)胞裂解液(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)、蛋白酶抑制劑(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、磷酸酶抑制劑和多種蛋白酶抑制劑購自中國BOSTER公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231、MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)在Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基、10%血清和1%青霉素-鏈霉素中，于37 ℃無菌不接觸CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組 根據(jù)不同的實驗需求分為4組，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)組加入1‰ PBS處理細(xì)胞，EGF組用10 nmol/L EGF處理細(xì)胞，EGF聯(lián)合Cal組用10 μmol/L Cal預(yù)處理細(xì)胞2 h后加入10 nmol/L EGF處理細(xì)胞，EGF聯(lián)合CI Ⅲ組用10 μmol/L CI Ⅲ預(yù)處理細(xì)胞2 h后加入10 nmol/L EGF處理細(xì)胞。

1.2.3傷口愈合實驗 將所需細(xì)胞接種于12孔板，正常培養(yǎng)細(xì)胞生長到90%以上后，采用200 μL黃色槍頭輕輕地在培養(yǎng)板底部劃一個十字，形成無細(xì)胞區(qū)域，然后用PBS清洗1～2次去除漂浮細(xì)胞；按照實驗設(shè)計加入藥物刺激，選取0 h和24 h時間點拍照，測量計算劃痕寬度，并計算細(xì)胞遷移率[24 h細(xì)胞遷移率(%)=實驗組(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/對照組(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)×100 %]，最后將對照組設(shè)為100 %，數(shù)據(jù)以條圖表示。

1.2.4Transwell小室實驗 Matrigel膠(美國Becton Dickinson公司)冰上融化后用無血清培養(yǎng)基按1 ∶8稀釋；吸取稀釋好的Matrigel膠100 μL于Transwell小室(美國Millipore公司)，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱1～3 h待完全凝固；用不含血清的培養(yǎng)基混勻預(yù)先處理好的細(xì)胞，取200 μL含有1.5×105個細(xì)胞的培養(yǎng)基加到小室，下室加入700 μL含有20%血清的培養(yǎng)基；細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，4%甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，棉簽擦掉小室內(nèi)細(xì)胞；顯微鏡10倍放大觀察，隨機(jī)取4個視野拍照計數(shù)，完全獨立實驗重復(fù)3次后統(tǒng)計處理結(jié)果。

1.2.5Western blot實驗 培養(yǎng)細(xì)胞到生長對數(shù)周期，對細(xì)胞進(jìn)行不同處理，利用新鮮配置的細(xì)胞裂解液(RIPA中加入PMSF、磷酸酶抑制劑、多種蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol/L)，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度；上樣蛋白樣品30 μg ，用10%PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜(美國Millipore公司)、5%脫脂奶粉(中國伊利)封閉1～2 h，加入稀釋好的抗體YAP(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000) 4 ℃搖晃過夜；吐溫-20-三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tris buffered saline with tween-20，TBST)洗膜3次、10 min/次，加入相應(yīng)的二抗(1 ∶4 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次、10 min/次；化學(xué)發(fā)光劑(美國Millipore公司)對蛋白進(jìn)行曝光顯色，Syngene Imaging系統(tǒng)進(jìn)行成像，條帶灰度處理分析目的蛋白表達(dá)量[目的蛋白表達(dá)量=目的條帶的(optical density，OD)值/內(nèi)參OD值×100%]分析。實驗重復(fù)3次后統(tǒng)計處理結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EGF對TNBC細(xì)胞遷移和侵襲的影響

傷口愈合實驗結(jié)果顯示， EGF組人源乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、468細(xì)胞的遷移率均高于PBS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A、1B；Transwell小室實驗結(jié)果顯示，EGF組人源乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、468細(xì)胞的侵襲率均高于PBS組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見圖1C、1D。

注：A為傷口愈合實驗，B為傷口愈合實驗的條圖，C為處理24 h時的Transwell實驗，D為處理24 h時的Transwell小室實驗的條圖；與PBS組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖1 EGF對MDA-MB-231、468細(xì)胞遷移率和侵襲率的影響Fig.1 Effects of EGF on mobility and invasion of MDA-MB-231 and 468 cells

2.2 EGF對TNBC細(xì)胞YAP表達(dá)的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，EGF組人源乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 YAP蛋白表達(dá)低于PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；EGF組人源乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468 YAP蛋白表達(dá)明顯高于PBS組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：A為Western blot實驗，B為Western blot實驗的條圖；與PBS組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖2 EGF對MDA-MB-231、468細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of EGF on YAP protein expression of MDA-MB-231 and 468 cells

2.3 CANP抑制劑對EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

傷口愈合實驗結(jié)果顯示，EGF聯(lián)合Cal組和EGF聯(lián)合CI Ⅲ組中MDA-MB-231、468細(xì)胞的遷移率均低于EGF組(P<0.05)，見圖3A、3B；Transwell實驗結(jié)果顯示，EGF聯(lián)合Cal組和EGF聯(lián)合CI Ⅲ組中MDA-MB-231、468細(xì)胞的侵襲率均低于EGF組(P<0.05)，見圖3C、3D。

注：A為傷口愈合實驗，B為傷口愈合實驗的條圖，C為處理24 h時的Transwell實驗，D為處理24 h時的Transwell實驗的條圖；(1)與EGF組比較，P<0.05。圖3 CANP抑制劑對EGF誘導(dǎo)MDA-MB-231、468細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effects of CANP inhibitors on migration and invasion of MDA-MB-231 and 468 cells induced by EGF

2.4 CANP抑制劑抑制對EGF誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞YAP表達(dá)的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，EGF聯(lián)合Cal組和EGF聯(lián)合CI Ⅲ組中MDA-MB-231、468細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)均低于EGF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

注：A為Western blot實驗，B為Western blot實驗的條圖；與EGF組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 CANP抑制劑對EGF誘導(dǎo)MDA-MB-231、468細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of CANP inhibitors on the expression of YAP in MDA-MB-231 and 468 cells induced by EGF

3 討論

乳腺癌發(fā)生在乳腺上皮細(xì)胞，是惡性程度極高的腫瘤之一，已威脅到全球女性的健康[16]。雖然全球科學(xué)家早已關(guān)注這種疾病，也為此做出了很多努力，如篩查工作和綜合治療的開展，但是死亡率沒有下降，反而發(fā)病率逐漸升高[17]。因此，TNBC高侵襲遷移特點在未來預(yù)防和治療乳腺癌過程中更應(yīng)成為重點關(guān)注點。有研究顯示，EGF通過激活Smad2/3上調(diào)幾種上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)標(biāo)記物[18]，同時增加乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231的遷移及侵襲能力；鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2在細(xì)胞中普遍表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)非溶酶體細(xì)胞質(zhì)需要鈣激活的半胱氨酸內(nèi)肽酶。CAPN的內(nèi)源特異性抑制劑是鈣蛋白酶抑制蛋白，證明了惡性和良性組織中酶表達(dá)之間的差異[19]。Salehin等[20]研究表明，通過抑制CANP可以達(dá)到增加乳腺癌細(xì)胞凋亡的效果，包括屬于HER2(+)或TNBC的SKBR3細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞；也有報道稱，在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號的作用下CANP2具有影響細(xì)胞黏附與遷移的能力，提示癌癥中CANP與腫瘤的許多惡性行為學(xué)相關(guān)[19]。以上研究表明在癌癥中CAPN與腫瘤的許多惡性行為學(xué)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Cal和CI Ⅲ能明顯抑制EGF對模型細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。結(jié)果表明，EGF對TNBC細(xì)胞的侵襲遷移能力的影響可能與CAPN信號通路相關(guān)，并且鈣蛋白酶抑制劑預(yù)處理模型細(xì)胞，可明顯抑制EGF對YAP蛋白的表達(dá)的影響，提示EGF通過CAPN信號通路對YAP蛋白產(chǎn)生影響。YAP是在人類惡性腫瘤中普遍激活的高度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，最近的研究表明，YAP對于癌癥的發(fā)生或大多數(shù)實體瘤的生長是必需的，它們活化、誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞屬性、增殖、藥物抗性和轉(zhuǎn)移，同時也是細(xì)胞微環(huán)境的結(jié)構(gòu)和機(jī)械特征的傳感器，許多癌癥相關(guān)的外在和內(nèi)在線索共同推翻正常組織的YAP抑制微環(huán)境，包括機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥及致癌信號傳導(dǎo)[14]。本研究結(jié)果表明，TNBC的MDA-MB-231與MDA-MB-468細(xì)胞中，EGF刺激可使YAP蛋白表達(dá)上調(diào)并且對細(xì)胞遷移、侵襲具有促進(jìn)作用，Cal和C I Ⅲ能抑制EGF對模型細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)和細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。

綜上所述，EGF具有誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞MDA-MB-231、468細(xì)胞遷移和侵襲，Cal和CIⅢ可以阻斷EGF的上述生物學(xué)效應(yīng)，EGF可能通過CANP-YAP信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。