譚艷， 寧麗常， 蹇孝麗， 蔣紅梅**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床微生物免疫教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床微生物免疫教研室， 湖南 長(zhǎng)沙 410219； 3.貴州中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，主要累及患者多個(gè)關(guān)節(jié)，引起關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)畸形，從而影響患者生活質(zhì)量[1]。RA患者約占世界人口的0.5%[2]，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)RA進(jìn)行了大量研究，但其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚[3]。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠是一種理想的、常用的RA動(dòng)物模型，具有與臨床RA患者相似的關(guān)節(jié)炎癥狀和病理改變[4]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)和IL-10是常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞因子[5-6]，本研究通過(guò)檢測(cè)CIA大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10探討RA的發(fā)病機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)雌性Sprague Dawley(SD)大鼠16只，體質(zhì)量250～320 g，恒溫恒濕環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。牛Ⅱ型膠原(Bovine Type Ⅱ Collagen，BⅡC，批號(hào)C7806)和福氏完全佐劑(F5881)購(gòu)自美國(guó)sigma公司，乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2，批號(hào)E8030)購(gòu)自北京索萊寶公司，TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒96T(批號(hào)ERC102a)購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司，IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒96T(批號(hào)JER-04)購(gòu)自安徽巧伊生物科技有限公司，IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒96T(批號(hào)BMS629)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒96T(批號(hào)EK380HS)購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司。

1.2 方法

1.2.1分組及處理 16只SD大鼠隨機(jī)分為CIA組和對(duì)照組，每組8只。CIA組大鼠予左足跖部皮內(nèi)注射乳化(冰上將BⅡC與CFA按 1 ∶1混勻達(dá)濃度為1 g/L，以乳劑滴于清水中不散開(kāi)為完全乳化)的BⅡC乳劑200 μL(初次免疫)，第14天尾根部皮內(nèi)多點(diǎn)注射相同劑量乳化的膠原(加強(qiáng)免疫)；對(duì)照組大鼠予以同劑量生理鹽水同法注射。

1.2.2關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分 分別在初次免疫后第7、14、21、28、35及42天觀察2組大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分是將無(wú)關(guān)節(jié)紅腫、趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微的紅腫、足趾關(guān)節(jié)以下部位出現(xiàn)腫脹、踝關(guān)節(jié)以下部位均出現(xiàn)腫脹和整個(gè)足爪均出現(xiàn)腫脹，依次評(píng)為0、1、2、3及4分，四肢得分累計(jì)為總分，總分0～16分[5]。

1.2.3蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色 初次免疫后第42天處死2組大鼠，取后左足踝關(guān)節(jié)去除皮膚和肌肉，10%中性甲醛溶液固定24 h，12.5% EDTA-Na2室溫中脫鈣，每2天換1次脫鈣液，30 d關(guān)節(jié)基本軟化后切片、HE染色，干燥并封片，顯微鏡下觀察脫鈣后關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化。

1.2.4血清TNF-α、IL-6、IFN-γ及IL-10檢測(cè) 初次免疫后第42天時(shí)麻醉狀態(tài)下大鼠股動(dòng)脈取血，2 000 r/min，離心10 min分離血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，雙抗體夾心法檢測(cè)各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ及IL-10的含量。檢測(cè)步驟為2倍倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣本和二抗、加酶溫育30 min，配洗液并洗板，避光顯色10 min，加終止液。所有檢測(cè)因子在加入終止液的5～30 min內(nèi)均在450 nm處檢測(cè)OD值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算血清中細(xì)胞因子的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 造模情況

對(duì)照組大鼠的關(guān)節(jié)在2次生理鹽水處理后均無(wú)明顯腫脹；CIA組大鼠在初次免疫后注射足第1天出現(xiàn)紅腫，第7天注射足腫脹明顯，第14天加強(qiáng)免疫后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)關(guān)節(jié)炎癥狀加重、關(guān)節(jié)指數(shù)升高，第21天大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)達(dá)到高峰、雙足紅腫現(xiàn)象越加明顯、隨著時(shí)間的延長(zhǎng)關(guān)節(jié)腫脹減退不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠足趾關(guān)節(jié)肉眼觀Fig.1 swelling joints of rats from both groups

2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

與對(duì)照組相比，CIA組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高；CIA組大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，第21天達(dá)到高峰，第28、35及42天關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降不明顯，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 HE染色

實(shí)驗(yàn)第42天足趾組織切片結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織可觀察到由排列整齊的滑膜細(xì)胞和滑膜下組織構(gòu)成，未看到破壞的關(guān)節(jié)面、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)節(jié)腔和新生的毛細(xì)血管(箭頭所示)；CIA組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織出現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎癥狀，即滑膜細(xì)胞明顯增生，層數(shù)明顯增多且排列紊亂，關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，新生血管和血管翳的明顯形成，軟骨表面有滑膜侵入，并破壞骨和軟骨組織(箭頭所示)。見(jiàn)圖2。

表1 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分Tab.1 Arthritis index scores of each

注：(1)與對(duì)照組相比，P<0.05。

圖2 兩組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織學(xué)觀察(42 d，HE)Fig.2 Histological characteristics of ankle joints of rats

2.4 血清TNF-α、IL-6、IFN-γ及IL-10水平

與對(duì)照組相比，CIA組大鼠血清TNF-α、IL-6及IFN-γ水平增高，IL-10水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 造模第42天時(shí)2組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ及IL-10水平Tab.2 Levels of TNF-α、IL-6、IFN-γ and IL-10 in rat

注：(1)與對(duì)照組相比，P<0.05。

3 討論

因RA的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，因此對(duì)其機(jī)制的探討成為了國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[7-8]。臨床資料表明，RA患者絕大多數(shù)為女性[9]，故本研究選擇SD雌性大鼠做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。CIA大鼠無(wú)論癥狀、病理學(xué)變化、免疫學(xué)改變及發(fā)病機(jī)制等方面和人類(lèi)RA患者的表現(xiàn)有許多相似的特征[10-12]，因而在實(shí)驗(yàn)中常用來(lái)作為研究RA的動(dòng)物模型[13]。RA是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病變累及全身各個(gè)臟器，但以關(guān)節(jié)受累最為嚴(yán)重[14]。本研究在CIA組大鼠足跟注射膠原，并于第14天尾根部注射同樣劑量的膠原后，第21天可見(jiàn)關(guān)節(jié)明顯腫脹畸形，直到第42天關(guān)節(jié)癥狀仍然明顯；對(duì)照組大鼠在2次生理鹽水處理后均未見(jiàn)關(guān)節(jié)腫脹。因此可以提示CIA組大鼠關(guān)節(jié)的腫脹畸形是由膠原所誘導(dǎo)的，且踝關(guān)節(jié)HE出現(xiàn)明顯的炎癥癥狀，可見(jiàn)該膠原已經(jīng)誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，因此本研究成功復(fù)制了CIA模型。

TNF-α是由激活的單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎癥因子，它可引起組織損傷并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[15]。在免疫反應(yīng)中，TNF-α可激活參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和炎癥反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子kB，研究表明TNF-α在炎癥患者機(jī)體的血清中含量明顯升高[16]。IL-6是由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞分泌的一種炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和自身免疫病[17]。在本研究中，CIA組大鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯升高，可推測(cè)CIA大鼠關(guān)節(jié)的炎癥變化可能與炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6改變有關(guān)。在輔助性T細(xì)胞(Helper T cell，Th)中，Th1細(xì)胞分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答[18-19]；Th2細(xì)胞分泌IL-10等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)機(jī)體炎癥并引起體液免疫應(yīng)答，參與抗體生成[20-21]。Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ可以促進(jìn)自身分化成熟，同時(shí)還抑制Th0向Th2分化，Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-10可促進(jìn)自身的分化成熟并增強(qiáng)Th2細(xì)胞而抑制Th1細(xì)胞的生成，同時(shí)與其他各種因素相互調(diào)節(jié)[22]。在正常機(jī)體中，Th1和Th2的細(xì)胞因子處于一種平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體存在炎癥反應(yīng)時(shí)，這種平衡將會(huì)被打破[23]。RA是一種常見(jiàn)的慢性自身免疫性疾病，分泌IFN-γ的促炎性Thl細(xì)胞和分泌IL-10的抗炎性Th2細(xì)胞在體內(nèi)失衡，在RA的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，RA模型小鼠中出現(xiàn)Thl/Th2的比值明顯升高的現(xiàn)象[25]，提示該模型小鼠中Th1細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子明顯升高，從而引起炎癥反應(yīng)。同時(shí)有報(bào)道認(rèn)為，Thl細(xì)胞可促進(jìn)RA病情的發(fā)展，而Th2細(xì)胞起到抑制炎癥的作用[26]。本研究結(jié)果顯示，與Th1有關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)水平增高，但與Th2有關(guān)的細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平降低，大鼠體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子比例失衡，Th1分泌的細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)，也論證了CIA的發(fā)生與Th1/Th2比例失衡有關(guān)。

綜上所述，CIA大鼠血清TNF-α、IL-6及IFN-γ水平的升高，IL-10水平的降低與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。