田薇， 李鳴， 喻艷琴， 張秀秀， 王嬋娟， 張婷， 單可人，官志忠， 何燕*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

燃煤污染型地方性氟中毒(簡稱燃煤污染型地氟病)是由于氟污染地區(qū)居民使用高氟煤而污染環(huán)境介質(zhì)或食物，從而引起以氟斑牙和(或)氟骨癥為主要特征的一種慢性全身性疾病[1-2]。氟骨癥是地氟病最嚴重的臨床癥狀之一，主要表現(xiàn)為骨硬化、骨軟化及骨質(zhì)疏松等癥狀[3-4]。有研究表明，氟骨癥的發(fā)病機制與骨的形成有極大的關(guān)系[5]，而核因子κB受體活化因子配體(receptor activatiw of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，其在巨噬細胞克隆刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)存在的前提下與破骨細胞膜上特異性受體RANK結(jié)合，啟動對破骨細胞的分化、成熟、活化的調(diào)節(jié)過程，抑制破骨細胞的凋亡，從而加速并增強骨吸收的過程[6-8]。多年來，陸續(xù)有研究報道了RANKL基因多態(tài)性與骨的形成相關(guān)疾病有關(guān)[9-10]，如王希丹等[11]研究發(fā)現(xiàn)RANKL基因的 rs9594738位點與髖部骨強度相關(guān)，Hsu 等[12]研究發(fā)現(xiàn)RANKL基因的 rs9594738位點與骨質(zhì)疏松有相關(guān)性，但目前RANKL基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與地氟病關(guān)系的研究尚未見報道。本研究旨在通過分析RANKL基因rs9594738位點在貴州燃煤污染型地氟病病區(qū)地氟病患者及對照縣人群中的多態(tài)性分布，探討該位點的多態(tài)性與燃煤污染型地氟病的關(guān)聯(lián)性，為燃煤污染型地氟病的發(fā)病機制、預(yù)防和治療提供一定的依據(jù)和線索。

1 對象與方法

1.1 對象

參照《地方性氟中毒病區(qū)劃分標(biāo)準(zhǔn)》(GB17018-1997) 劃分貴州省地氟病病區(qū)。在知情同意原則下，按照簡單隨機抽樣原則，在貴州省畢節(jié)市典型燃煤污染型地方性氟中毒病區(qū)采樣(統(tǒng)稱為疾病組)。疾病組根據(jù)地氟病的嚴重程度分為地氟重癥組(地氟病病區(qū)有氟骨癥且氟斑牙明顯患者)130例，男35例、女95例，平均年齡(59.49±11.61)歲；地氟輕癥組(地氟病病區(qū)僅有氟斑牙患者)235例，男80例、女155例，平均年齡(52.38±14.48)歲。以黔南布依族苗族自治州長順縣的樣本 235例為對照組(無氟污染地區(qū)無地氟病癥狀人群)，男94例、女141例，平均年齡(48.75±16.97)歲。

1.2 方法

1.2.1模板標(biāo)化 從實驗室-80 ℃冰箱中取出樣本全血基因組DNA，使用Thermo ScientificTMNanoDrop Lite對全血基因組DNA定量后，標(biāo)化至3 mg/L。

1.2.2基因分型 采用TaqMan-MGB 實時熒光定量PCR法對RANKL基因rs9594738位點進行基因分型。PCR反應(yīng)總體系為10 μL，其中3 mg/L DNA溶液1.0 μL，TaqMan genotyping Master MixⅡ 3 μL，rs9594738探針 0.15 μL，加無菌ddH2O補足至10 μL；PCR反應(yīng)條件為60 ℃ 30 s，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，循環(huán)40次， 60 ℃ 30 s結(jié)束反應(yīng)。采用Step One Software v2.3軟件對擴增結(jié)果進行分析。完成檢測后各種基因型隨機抽取5%的樣本進行測序驗證，測序結(jié)果與分型結(jié)果100%相符。

1.2.3測序驗證 從分型結(jié)果中將不同基因型隨機各抽取5%樣本送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。測序引物為上游5′- GCCTGTGGCTTGTGGGTAT-3′,下游 5′-TCTCTGATGTTTGTGGGGGA-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗檢測研究對象rs9594738位點的基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡以及SNP的等位基因、基因型頻率在各組間的分布差異、性別分布差異；利用SNPStats在線軟件對RANKL基因rs9594738位點進行遺傳模式分析，包括共顯性遺傳模式(Codominant model)、顯性遺傳模式(Dominant model)、隱性遺傳模式(Recessive model)、超顯性遺傳模式(Overdominant model)和加性遺傳模式模(Log-Additive model)，并根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則(akaike information criterion,AIC) 和貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesian information criterions,BIC) 數(shù)值的大小來確定SNP位點的最優(yōu)遺傳模式，即AIC和BIC數(shù)值同時取最小值時的遺傳模式。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RANKL基因分型

人基因組RANKLrs9594738位點的熒光定量PCR擴增曲線結(jié)果顯示，RANKL基因rs9594738位點均有CC、CT及TT基因型，見圖1；采用Step One Software v2.3軟件對Real-time PCR擴增分析，結(jié)果顯示RANKL基因rs9594738位點在地氟病人群和對照組人群中均存在C和T等位基因以及CC、CT、TT 3種基因型，見圖2。

注：紅線為CC野生純合型，綠線為CT雜合型，藍線為TT突變純合型。圖1 RANKL基因rs9594738位點TaqMan-MGB探針介導(dǎo)的實時熒光定量PCR擴增曲線Fig.1 RANKL rs9594738 TaqMan-MGB probe mediated real-time fluorescence quantitative PCR amplification curve

注：紅點為CC野生型，綠點為CT雜合型，藍點為TT突變純合型，“X”為未確定。圖2 RANKL基因 rs9594738位點基因分型Fig.2 RANKL gene rs9594738 locus genotypic results

2.2 測序驗證

按照基因分型結(jié)果，隨機從RANKL基因rs9594738位點各基因型樣本中選取5%的樣本進行測序驗證(不足5例的基因型全部樣本測序)，測序結(jié)果與TaqMan-MGB探針介導(dǎo)的實時熒光定量PCR基因分型的結(jié)果完全符合。見圖3。

注：箭頭所示A為TC雜合型，B為CC野生型，C為TT突變純合型；紅色為堿基T，綠色為堿基A，藍色為堿基C，黑色為堿基G。圖3 RANKL基因 rs9594738位點測序Fig.3 Sequencing of RANKL gene rs9594738 locus

2.3 RANKL基因 rs9594738位點的基因型頻率和等位基因頻率分布

各組人群RANKL基因 rs9594738位點的基因型頻率和等位基因頻率分布情況顯示，地氟重癥組、地氟輕癥組人群分別與對照組人群的基因型頻率分布構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，地氟輕癥組人群與對照組人群的等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但地氟重癥組人群與對照組人群的等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組人群RANKL基因rs9594738 位點基因型分布頻率和等位基因頻率分布Tab.1 Genotype and allele frequency distribution of RANKL rs9594738 locus in each group

注：(1)與對照組比較的χ2值。

2.4 RANKL基因 rs9594738位點基因型頻率及等位基因頻率分布的性別差異

基因頻率及等位基因頻率結(jié)果顯示，各組人群RANKL基因 rs9594738位點基因型分布頻率和等位基因頻率分布的性別差異結(jié)果顯示，地氟輕癥組和對照組的基因型頻率分布構(gòu)成和等位基因頻率的性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；但地氟重癥組和對照組男女之間基因型頻率分布構(gòu)成和等位基因頻率的性別比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組人群RANKL基因 rs9594738位點多態(tài)性分布的性別差異Tab.2 Gender differences in the polymorphism distribution of RANKL rs9594738 in each group

2.5 疾病組人群RANKL基因rs9594738位點的遺傳模式

利用SNPStats在線軟件對疾病組和對照組的RANKL基因rs9594738位點的等位基因進行遺傳模式分析，結(jié)果顯示RANKL基因rs9594738位點的最優(yōu)遺傳模式是超顯性遺傳模式，在該模式下C/T基因型與地氟病的發(fā)病風(fēng)險無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 疾病組和對照組人群RANKL基因rs9594738位點的遺傳模式Tab.3 Allele and genotype distribution of RANKL rs9594738 in disease group and control group

2.6 地氟重癥組人群RANKL基因 rs9594738位點的遺傳模式

利用SNPStats在線軟件對地氟重癥組和對照組的RANKL基因rs9594738位點的等位基因進行遺傳模式分析，結(jié)果顯示RANKL基因 rs9594738位點的最優(yōu)遺傳模式是顯性遺傳模式，在該模式下C/T和T/T基因型增加了地氟病的發(fā)病風(fēng)險(P<0.05)。見表4。

表4 地氟重癥組人群和對照組人群RANKL基因 rs9594738位點的遺傳模式Tab.4 Genetic pattern analysis of RANKL rs9594738 in severe fluorine group and control group

2.7 地氟輕癥組人群RANKL基因 rs9594738位點的遺傳模式

利用SNPStats在線軟件對地氟輕癥組和對照組的RANKL基因rs9594738位點的等位基因進行遺傳模式分析，結(jié)果顯示RANKL基因 rs9594738位點的最優(yōu)遺傳模式是隱性遺傳模式，在該模式下T/T基因型與地氟病的發(fā)病風(fēng)險無關(guān)(P>0.05)。見表5。

表5 地氟輕癥組人群RANKL基因 rs9 594738位點的遺傳模式分析 Tab.5 Genetic pattern analysis of RANKL gene rs9594738 in mild fluorine group

3 討論

地氟病是一種嚴重危害身體健康的全身性疾病，分為飲水、飲茶和燃煤型氟中毒，臨床主要表征為氟斑牙和氟骨癥[13-14]。貴州是全國最嚴重的燃煤污染型地方性氟中毒病區(qū)[15]，官志忠等[16]研究發(fā)現(xiàn)貴州省燃煤型地氟病區(qū)主要分在貴州省的西部、西北部和北部，包括畢節(jié)市、六盤水市各縣區(qū)。其中爐灶使用及其燃煤方式是貴州省燃煤污染型地氟病流行的主要因素，由于農(nóng)村居民長期使用無排煙設(shè)施的爐灶，燃煤過程排放的含氟煙塵嚴重污染室內(nèi)空氣和食物，使生活在這一環(huán)境的人群因過量攝氟而引起慢性蓄積性氟中毒[17-18]。RANKL基因位于染色體13q14，RANKL蛋白包括317個氨基酸殘基，成骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞和成纖維細胞等是其主要來源[19]。RANKL是破骨細胞增殖、分化和存活的關(guān)鍵[20]。有研究報道RANKL基因rs2277438位點多態(tài)性可能在骨重建過程中起著重要的作用[21]；Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)RANKL基因rs784870位點的CC型基因與OPG基因rs2073618位點的CC型基因是漢族乳腺癌患者使用芳香化酶抑制劑，導(dǎo)致骨密度降低的風(fēng)險基因型；亦有研究表明RANKL基因的rs9594738位點的單核苷多態(tài)性與骨質(zhì)疏松等骨骼疾病有關(guān)[23]。地氟病的主要癥狀之一是氟骨癥，主要表現(xiàn)為骨硬化、骨軟化及骨質(zhì)疏松等癥狀，是在特定地理環(huán)境中過量氟暴露而引起的全身慢性蓄積性氟中毒[24-25]。已有研究表明RANKL基因的表達強度與氟骨之間存在正相關(guān)關(guān)系[26]，但目前對于RANKL基因在地氟病中的多態(tài)性研究報道較少。本研究結(jié)果顯示地氟重癥組人群等位基因頻率分布與對照組人群相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，從地氟重癥組人群等位基因頻率與對照組人群相比的結(jié)果來看，RANKL基因rs9594738位點多態(tài)性可能與氟骨癥的發(fā)病有相關(guān)性，這與RANKL基因的表達和Ⅱ型骨質(zhì)疏松具有相關(guān)性一致[27]。

地氟重癥組和地氟輕癥組人群RANKL基因rs9594738位點多態(tài)性分布的性別差異比較結(jié)果顯示，地氟輕癥組和對照組的基因型頻率分布構(gòu)成和等位基因頻率的性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但地氟重癥組男女之間基因型頻率分布構(gòu)成和等位基因頻率的性別差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果提示RANKL基因rs9594738位點在地氟重癥組人群中男女之間的分布可能存在差異。對疾病組和對照組進行遺傳模式分析，結(jié)果顯示在最優(yōu)遺傳模式超顯性遺傳模式下，RANKL基因rs9594738位點的C/T基因型與地氟病的發(fā)生無關(guān)(P>0.05)，對地氟重癥組和對照組進行遺傳模式分析，結(jié)果顯示在最優(yōu)遺傳模式顯性遺模式下，RANKL基因rs9594738位點C/T基因型與T/T基因型可能與氟骨癥的發(fā)生有關(guān)(P<0.05)。對地氟輕癥組與對照組進行遺傳模式分析，結(jié)果顯示在最優(yōu)遺傳模式隱性遺傳模式下T/T基因型與地氟病的發(fā)生無關(guān)(P>0.05)。

綜上所述，本研究顯示RANKL基因rs9594738位點多態(tài)性與貴州省畢節(jié)市地氟病區(qū)患氟骨癥的可能有關(guān)，且其發(fā)病情況在男女之間可能存在差異；但是由于本研究樣本量相對較少，容易產(chǎn)生統(tǒng)計偏差，因此還需要大樣本量的研究進一步證實上述結(jié)果，從而進一步闡述RANKL基因rs9594738位點與地氟病的相關(guān)性。