賈藝悅，牟感恩，孟 鑫，沈 秀，周則衛(wèi)，龍 偉

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192)

由于新藥研發(fā)成本高，失敗率高，周期長[1]，近年來老藥新用作為藥物開發(fā)策略越來越受到重視[2]，并由此誕生了大量的新適應癥藥物。雙硫侖(disulfiram，DSF)，分子式為C10H20N2S4，化學名為二硫化四乙基秋蘭姆，又稱戒酒硫、酒畏等，商品名為安塔布司(Antabuse)，是一種較有前途的抗癌藥物。早先發(fā)現(xiàn)DSF可以用于治療酒精依賴，抑制酒精代謝過程中的乙醛脫氫酶，導致毒性物質(zhì)乙醛在人體內(nèi)大量累積，引起機體多種不適，達到戒酒目的[3]；并且具有良好的安全性和耐受性[4]。在過去30年中，有報道DSF對多種腫瘤細胞株具有良好的體外抗腫瘤活力性[5-8]，如乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌和前列腺癌等。DSF抑制泛素蛋白酶體/核轉(zhuǎn)錄因子NFκB通路、多藥耐藥基因MDR1的表達、拓撲異構(gòu)酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、核蛋白定位因子NPL4，調(diào)控MAP激酶通路。它能根除腫瘤干細胞(CSCs)，顯著逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細胞的耐藥性[9-13]。有研究報道，DSF的抗腫瘤機制為：在血清中迅速被還原為DDC，DDC是一種很強的過渡二價金屬離子螯合劑，可結(jié)合銅離子。DSF接觸銅離子的瞬間可觸發(fā)活性氧產(chǎn)生，損傷DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)從而誘導腫瘤細胞死亡；而DDC與銅離子螯合形成的最終復合物會產(chǎn)生更強更持久的殺傷作用[14]，DSF在血清中的轉(zhuǎn)化過程見圖1。DDC的硫醇基團是活性基團，秋蘭姆結(jié)構(gòu)及氮原子對其發(fā)揮活性是必不可少的[15]。在此基礎(chǔ)上，我們對DSF結(jié)構(gòu)進行改造，保留中間四個硫的活性部位，將兩邊換為對稱的哌嗪基團，哌嗪基團比DSF多1個叔胺的堿性基團，會有一定線粒體靶向性。故此期望得到有更好抗腫瘤活性的衍生物。

圖1 DSF在血清中的轉(zhuǎn)化及活性形式

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器和RE-5299循環(huán)式真空水泵，購自鞏義予華儀器責任有限責任公司；BuChiR-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自瑞士BuChi公司；DZF-6020真空干燥箱，購自上海精宏儀器有限公司；紫外分光光度計，購自上海光譜儀器有限公司；GF254薄層層析硅膠板，購自煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；核磁共振波譜儀，購自德國Bruker公司；多色熒光化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)，購自德國Alliance公司。人乳腺癌細胞MCF-7和人肺癌細胞A549，均由北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)研究所提供。流式分析儀，購自美國BDbioscience公司。DSF(純度＞99%)、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自大連美侖生物公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自以色列BI公司；磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-碘化吡啶Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，購自凱基生物有限公司；PARP抗體和BAX抗體，購自美國Proteintech公司。

1.2 DSF衍生物的合成

胺、二硫化碳在KOH、NaOH或NaH等強堿存在下反應，在適當?shù)娜軇┲?常用乙醇作溶劑)形成對應的氨基二硫代甲酸鹽，然后，再用碘單質(zhì)將其氧化可得目標化合物。

衍生物DSF-1的合成步驟如下：取2 mL甲基哌嗪，溶于少許乙醇，加入溶有0.72 g NaOH的1 mL的水溶液，冰水浴下緩慢滴加1.1 mL二硫化碳，溶液起初為淡綠色，很快變?yōu)橥咙S色。室溫攪拌約6 h，體系為棕黃色。分次加入2.3 g碘單質(zhì)的2 mL的乙醇溶液，很快有白色沉淀析出，反應4 h體系為淡黃色，最后得到白色粉末2.085 g，產(chǎn)率33.04%。合成路線見圖2。薄層層析(二氯甲烷∶甲醇=8∶1)顯示為1個點。純化后通過質(zhì)譜和核磁氫譜、碳譜確證化合物的結(jié)構(gòu)，為雙(4-甲基-1-1-哌嗪基硫代甲?；?二硫。

圖2 DSF-1的合成路線

衍生物DSF-2的合成步驟如下：取2 mL乙基哌嗪，溶于少許乙醇，加入含有0.63 g NaOH的1 mL的水溶液，冰水浴下緩慢滴加0.95 mL二硫化碳，溶液起初為淡綠色，很快變?yōu)榈S色。室溫攪拌約6 h，體系為棕黃色。分次加入2.0 g碘單質(zhì)的2 mL的乙醇溶液，很快有大量白色物質(zhì)析出，反應4 h后體系變?yōu)榈S色，最終得到白色粉末1.504 g，產(chǎn)率25.24%，合成路線見圖3。薄層層析(二氯甲烷∶甲醇=8∶1)為1個點，純化后通過質(zhì)譜和核磁氫譜、碳譜確證化合物的結(jié)構(gòu)，為雙(4-乙基-1-1-哌嗪基硫代甲?；?二硫。

圖3 DSF-2的合成路線

1.3 細胞培養(yǎng)

MCF-7和A549細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、CO2體積分數(shù)5%、相對濕度95%。細胞生長覆蓋95%皿底面積時傳代。

1.4 細胞增殖情況檢測

受試物用DMSO溶解后，用DMEM培養(yǎng)基將其稀釋為50、10、5、1和0.5μmol/L的溶液；含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將其稀釋為10、5、1、0.5、0.1 μmol/L的溶液。NAC用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基溶解，濃度為1 mmol/L。

細胞處于對數(shù)生長期時胰酶消化，用細胞計數(shù)板計算細胞密度，按每孔5 000個細胞種于3個96孔板中，孵育24 h。待細胞貼壁并穩(wěn)定生長后棄去舊培養(yǎng)液，第1個96孔板加入含10%FBS的DMEM配置的不同濃度的受試物溶液100μL，空白孔加入10%FBS的DMEM。第2個96孔板先加入含10%FBS的DMEM配置的不同濃度的受試物溶液50μL，每個孔再加入配好的NAC溶液50μL混勻，空白孔為10%FBS的DMEM和NAC溶液的混合液。第3個96孔板加入DMEM配置的不同濃度的溶液100μL，空白組為DMEM。每個濃度均設(shè)3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入CCK-8溶液，37℃避光孵育，經(jīng)酶標儀在480 nm處檢測吸光度值，利用Graphpad軟件計算IC50值，繪制存活率圖，并進行t檢驗。細胞存活率為試驗孔吸光度值與對照孔吸光度值的比值。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

受試物均用DMSO溶解，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將DSF稀釋為50、30μmol/L的溶液，將DSF-1和DSF-2稀釋為20、10μmol/L的溶液。NAC用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基溶解，濃度為1 mmol/L。對數(shù)生長期的A549細胞和MCF-7細胞進行消化離心計數(shù)，6孔板每孔鋪20萬個細胞，孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，按加入化合物的不同，以及是否含NAC，將MCF-7和A549細胞分為6個處理組，見表1。

表1 MCF-7和A549細胞的分組

作用24 h后收集死亡細胞，其余細胞用PBS沖洗并用胰酶消化收集并離心。將離心后的細胞重新懸浮在500μL緩沖液中，依次加入5μL FITC和5μL PI避光反應15 min。然后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。用BD Accuri C6軟件進行分析，直接可得細胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測

取對數(shù)生長期的A549細胞和MCF-7的細胞消化離心計數(shù)，六孔板每孔鋪20萬個細胞，孵育24 h。棄去培養(yǎng)基。受試物用DMSO溶解后，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋。MCF-7細胞各孔分別加入30 μmol/L的DSF溶液，10μmol/L的DSF-1溶液，10 μmol/L的DSF-2溶液，均為2 mL；A549細胞各孔分別加入50μmol/L的DSF溶液，20μmol/L的DSF-1溶液，20μmol/L的DSF-2溶液，均為2 mL。

作用24 h，收集細胞，常規(guī)裂解制備蛋白樣品，經(jīng)BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。每組各取40μg總蛋白進行 SDS-PAGE，隨后將蛋白印跡轉(zhuǎn)到PVDF膜上，經(jīng) 5%脫脂奶粉封閉、相應一抗溶液(1∶1 000稀釋)4℃孵育，以及合適的二抗溶液(1∶3 000稀釋)孵育。最后采用ECL化學發(fā)光顯色試劑孵育曝光，相關(guān)結(jié)果采用多色熒光化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行拍照，Image J分析條帶灰度值。

蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

1.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗均3次重復，用統(tǒng)計軟件Graphpad Prism 8進行數(shù)據(jù)分析及t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 衍生物的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 DSF-1 白色固體，m.p.143.6～144.8℃；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：2.38(s,6H,CH3),2.61[t,8H,N(CH2)2],4.34[t,8H,CSN(CH2)2]；13C NMR(CDCl3)δ： 193.55(CS2),54.53(NCCN),45.61(CH3)； LC-MS m/z： 351.081(M+)。為雙(4-甲基-1-1-哌嗪基硫代甲?；?二硫。

2.1.2 DSF-2 白色固體，m.p.118.6～119.6℃；1H NMR(CDCl3，400 MHz) δ：4.34[t,8H,SCN(CH2)2],2.65[t,8H,N(CH2)2],2.5(q,J=7.2HZ,4H),1.15(t,J=7.2HZ,6H,CH3)；13C NMR(CDCl3)δ：193.35(CS2),51.84(CH2),52.3(NCCN),12.00(CH3)；LC-MS m/z：379.110(M+)。為雙(4-乙基-1-1-哌嗪基硫代甲?；?二硫。

2.2 CCK-8實驗結(jié)果

用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配制DSF及其2個衍生物，作用于MCF-7和A549細胞，CCK-8實驗檢測細胞增殖情況，結(jié)果見表2?？梢娮饔脮r間在48 h時，兩個衍生物對兩種腫瘤細胞的抑制作用強于DSF，IC50的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表2 DSF和衍生物分別作用于兩種腫瘤細胞48 h時的IC50

DSF及其2個衍生物在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細胞的增殖抑制作用見圖4～圖6?？梢婓w系中含F(xiàn)BS時，DSF及其2個衍生物作用下的MCF-7和A549細胞存活率均較不含F(xiàn)BS時降低，這一結(jié)果也與其他文獻的報道一致[17]?？赡艿脑蚴且騀BS中有銅離子，DSF及其衍生物抑制這兩種腫瘤細胞的增殖需要銅離子的存在。

此外，NAC可以抑制ROS的產(chǎn)生，DSF及其2個衍生物在含與不含NAC兩種條件下對MCF-7和A549細胞的增殖抑制作用見圖7～圖9?？梢婓w系中含NAC時，DSF及其2個衍生物作用下的MCF-7和A549細胞存活率均較不含NAC時升高(P＜0.05或P＜0.01)，提示DSF及其2個衍生物可能是通過產(chǎn)生ROS發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。

圖4 DSF在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細胞的增殖抑制作用

圖5 DSF-1在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細胞的增殖抑制作用

圖6 DSF-2在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細胞的增殖抑制作用

圖7 DSF在含與不含NAC兩種條件下對兩種腫瘤細胞的增殖抑制作用

圖8 DSF-1在含與不含NAC兩種條件下對兩種腫瘤細胞的增殖抑制作用

圖9 DSF-2在含與不含NAC兩種條件下對兩種腫瘤細胞的增殖抑制作用

2.3 細胞凋亡情況

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖10，可見與DSF相比，DSF-1和DSF-2作用后的MCF-7和A549細胞凋亡比例均增加(P＜0.05或P＜0.01)；與不加NAC相比，DSF-1和DSF-2加入NAC作用后的MCF-7和A549細胞凋亡比例減少(P＜0.05或P＜0.01)。

圖10 DSF及其2種衍生物對MCF-7和A549細胞凋亡的影響

2.4 Western blot實驗結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果見圖11和圖12，可見與對照組比較，DSF-1和DSF-2作用后MCF-7和A549細胞的PARP表達水平降低(P＜0.05或P＜0.01)，DSF及其2種衍生物作用后MCF-7和A549細胞的BAX表達水平升高(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討論

雙硫侖發(fā)揮抗腫瘤作用主要是依賴于秋蘭姆結(jié)構(gòu)及氮原子[15]。我們在前期大量的結(jié)構(gòu)改造衍生物中篩選出了哌嗪環(huán)連接簡單基團這一結(jié)構(gòu)特征的衍生物，衍生物1和衍生物2活性較為突出。

雙硫侖誘導氧化應激，可以增加黑色素瘤細胞的ROS水平，其活性能夠被外源性的抗氧化劑抑制[5]。Colin等發(fā)現(xiàn)雙硫侖對人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-BE及人膠質(zhì)母細胞瘤UVW的抑制作用在有血清時呈雙相作用，在低濃度時加入銅離子螯合劑時DSF失去活性，表明DSF/Cu復合物發(fā)揮抗腫瘤作用；在高濃度時加入NAC，DSF失去活性，表明氧化應激占主導[17]。而在本實驗選擇的兩種腫瘤細胞中DSF及兩個衍生物的抑制作用呈劑量依賴，并且在不加血清時完全失去活性。血清中有15μmol/L銅離子，10%～15%的血清中有1.5～2.3μmol/L銅離子[16]，因此衍生物發(fā)揮抗腫瘤作用需要血清中的銅離子。同時我們也觀察到在兩種腫瘤細胞中，抗氧化劑會明顯抑制衍生物的活性，證明其通過產(chǎn)生ROS發(fā)揮抗腫瘤作用。流式細胞術(shù)證明了DSF及兩個衍生物可以誘導腫瘤細胞凋亡，并且這種作用可以被NAC抑制。

圖11 DSF及其2種衍生物對MCF-7細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖12 DSF及其2種衍生物對A549細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

細胞凋亡分為3種途徑：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑，死亡受體途徑和線粒體途徑。研究報道雙硫侖通過調(diào)節(jié)線粒體通路相關(guān)蛋白誘導腫瘤細胞凋亡。BCL-2家族蛋白中促凋亡與促存活蛋白之間的相互作用控制著細胞色素C等物質(zhì)從線粒體釋放。其中BAX是研究最廣泛的促凋亡蛋白，存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到凋亡信號誘導時，BAX構(gòu)象改變向線粒體轉(zhuǎn)位并形成二聚體，PT孔打開，細胞色素C及凋亡誘導因子從線粒體釋放入細胞質(zhì)，促進蛋白水解及caspase激活[18]。多聚ADP核糖聚合酶(PARP)是一類存在于多數(shù)真核細胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，在維持基因組的完整性方面起著關(guān)鍵作用。在細胞凋亡過程中，激活的caspase-3將PARP酶剪切為89 kD和24 kD兩個片段，使其失去PARP原酶的正常功能。Western blot實驗結(jié)果表明衍生物可以增加兩種腫瘤細胞中BAX的表達，減少PARP酶的表達。但具體的機制需要進一步研究。同時，還需要進一步的體內(nèi)荷瘤實驗確證衍生物的抗腫瘤活性。

綜上所述，合成的兩個雙硫侖衍生物具有一定的體外抗腫瘤功效，優(yōu)于雙硫侖，且其活性與銅離子的存在密切相關(guān)。其機制可能與凋亡相關(guān)蛋白的表達，以及增加腫瘤細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生相關(guān)。