紀(jì) 猛，張媛媛，汪瑞辰

江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南京 210009

隨著生活水平的提高，人們的生活習(xí)慣和飲食方式發(fā)生了很大的改變，尤其是“紅肉”飲食的大量攝入[1，2]，使得我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重影響了人們的生存周期和生活質(zhì)量。結(jié)腸癌具有增殖速率快、能量代謝旺盛、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的特點(diǎn)[3，4]，因而對(duì)于開(kāi)發(fā)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物顯得極為緊迫。經(jīng)典的結(jié)腸癌治療藥物的研發(fā)從化合物的篩選到成藥需要數(shù)十年時(shí)間和數(shù)億元的經(jīng)費(fèi)投入，嚴(yán)重限制了結(jié)腸癌的有效治療，因而從臨床常用的經(jīng)典藥物入手，“老藥新用”的研發(fā)方式為藥學(xué)專(zhuān)家所關(guān)注。雙硫侖（disulfiram）[5]是一種常用的廉價(jià)戒酒藥物，因其能夠不可逆地抑制胞質(zhì)內(nèi)和線粒體內(nèi)的乙醛脫氫酶，使嗜酒者轉(zhuǎn)而對(duì)飲酒產(chǎn)生厭惡和恐懼心理，從而放棄酗酒而達(dá)到戒酒目的。同時(shí)毒理學(xué)研究表明，單獨(dú)使用雙硫侖對(duì)機(jī)體不產(chǎn)生毒性作用，更可貴的是，研究表明，雙硫侖具有潛在的抗腫瘤潛力[6，7]且具體機(jī)制不清。因而，本研究通過(guò)體內(nèi)體外細(xì)胞和移植瘤實(shí)驗(yàn)考察雙硫侖的抗結(jié)腸癌作用，并通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（Glucose transporter 1，GLUT1）信號(hào)通路[8，9]對(duì)其潛在的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

雙硫侖 （批號(hào)S826357，Selleck公司）；順鉑（Cisplatin，批號(hào) S117264，Selleck 公司）；MTS 試劑盒（Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit，Biovision公司）；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；Matrigel基底膜基質(zhì)（批號(hào)6235007，美國(guó)BD公司）；HIF-1α和GLUT1單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；小鼠SP檢測(cè)試劑盒（索萊寶公司）；其余試劑為化學(xué)純，均購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)有限公司；純化水（自制）。

1.2 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.3 動(dòng)物

BALB/c裸小鼠18只，體重18～22 g，均為雄性，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：201810315，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007。動(dòng)物自由飲水飲食，光照/黑暗時(shí)間12 h/12 h，環(huán)境溫度22℃～24℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平（型號(hào)BSA224S-CW，Sartorius科學(xué)儀器廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)3110，美國(guó)Thermo公司）；多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)GM3500，美國(guó)Promega公司）；純水儀（型號(hào)TANKPE060，美國(guó)Millipore公司）。

2 方 法

2.1 雙硫侖對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

采用MTS法對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)。采用0.25%胰酶對(duì)SW480細(xì)胞進(jìn)行消化后，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞于96孔板中（100μL）。細(xì)胞貼壁后，吸去舊培養(yǎng)基，加入100 μL的新鮮含藥培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)共分7個(gè)組，每組6個(gè)平行孔。各組雙硫侖濃度分別為0、2、4、8、16、32、64 μmol·L-1或順鉑濃度分別為 0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1。 藥物分別處理 24 h或48 h后每孔加入20 μL MTS，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2h后于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度值。

2.2 雙硫侖對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞消化后，每孔接種3×105個(gè)SW480細(xì)胞于6孔板中（2 mL）。細(xì)胞貼壁后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去上清液，無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞兩次后，用白色的10 μL槍頭沿每孔的中線垂直劃痕。然后無(wú)菌PBS繼續(xù)清洗兩次，加入100 μL的新鮮含藥培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)共分4組，分別為：對(duì)照組、順鉑組和雙硫侖 4 μmol·L-1組、8μmol·L-1組，各組分別加入 PBS、順鉑 2.5μmol·L-1、雙硫侖 4 μmol·L-1、8 μmol·L-1。每組設(shè)置 3 個(gè)平行孔。24 h后分別于100倍顯微鏡下拍照。細(xì)胞遷移率（%）=（1-24 h劃痕寬度/0 h時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）×100%。

2.3 雙硫侖對(duì)SW480細(xì)胞侵襲的影響

采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。于Transwell小室上室的膜表面均勻鋪被含Matrigel（去生長(zhǎng)因子）的 DMEM培養(yǎng)基稀釋液（1∶4，體積比），置培養(yǎng)箱中稍微受熱使其凝固。將5×103個(gè)SW480細(xì)胞接種在Transwell小室的上室，同時(shí)于上室加入100 μL含藥培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)共分4組，分別為：對(duì)照組、順鉑組和雙硫侖 4 μmol·L-1組、8 μmol·L-1組，各組分別加入 PBS、順鉑 2.5 μmol·L-1、雙硫侖 4 μmol·L-1組、8 μmol·L-1。每組設(shè)置 3 個(gè)平行孔。Transwell下室加入 600 μL含 20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。藥物處理結(jié)束后，用棉簽小心將上室中沒(méi)有遷移的細(xì)胞拭去，將上室底部的膜取下，并按下述操作處理：用4%多聚甲醛固定10 min→PBS洗滌→0.1%結(jié)晶紫染色30 min→PBS漂洗3次→置載玻片上→200×鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)后、計(jì)算每個(gè)視野的平均值。

2.4 雙硫侖對(duì)SW480荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

SW480細(xì)胞經(jīng)大量培養(yǎng)后，胰酶消化后DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。采用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至2×107/mL，后加入等體積的Matrigel膠混合均勻，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×107/mL。于Balb/c裸鼠右下肢皮下接種細(xì)胞懸液，每只接種體積為0.2mL。觀察腫瘤體積，待瘤塊直徑達(dá)0.5～1.0cm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為模型組、雙硫侖20mg·L-1組、40mg·L-1組。 采用灌胃給予相應(yīng)的雙硫侖或生理鹽水，給藥體積為0.4 mL/20 g體重，實(shí)驗(yàn)共21 d。用游標(biāo)卡尺每3天測(cè)量各組裸鼠瘤體積，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出瘤組織，進(jìn)行拍照并稱(chēng)重，腫瘤組織以4%的多聚甲醛固定以進(jìn)行后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)。腫瘤體積計(jì)算方法：V=A×B2×0.5，其中A為腫瘤最長(zhǎng)直徑，B為腫瘤最短直徑。

2.5 雙硫侖對(duì)SW480荷瘤裸鼠腫瘤組織中HIF-1α和GLUT1蛋白表達(dá)的影響

采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中的HIF-1α和GLUT1蛋白表達(dá)水平。將固定后的腫瘤組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋及切片，6μm厚度為宜，切片經(jīng)脫蠟水化，先經(jīng)過(guò)氧化物阻斷、非免疫性動(dòng)物血清保護(hù)后，加入HIF-1α和GLUT1一抗（1∶200進(jìn)行稀釋?zhuān)┓跤^(guò)夜，清洗封閉后，加入生物素標(biāo)記的二抗孵育、鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶等步驟，進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。晾干后顯微鏡400倍進(jìn)行拍照。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)HIF-1α和GLUT1蛋白的光密度值，計(jì)算平均光密度。平均光密度值=累計(jì)光密度/面積。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行作圖分析，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），Student-Newman-Keuls post hoc檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 雙硫侖對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖具有抑制作用

采用不同濃度的雙硫侖分別處理SW480結(jié)腸癌細(xì)胞24 h和48 h，MTS結(jié)果顯示，雙硫侖16、32、64 μmol·L-1濃度時(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雙硫侖處理結(jié)腸癌細(xì)胞24 h和48h 的 IC50分別為 42.12μmol·L-1和 33.77 μmol·L-1（見(jiàn)圖1）。同時(shí)，順鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞24h和48h的IC50分別為 16.62μmol·L-1和 15.20μmol·L-1。實(shí)驗(yàn)表明，雙硫侖能夠明顯抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

3.2 雙硫侖抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移

選取了對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響的雙硫侖4μmol·L-1、8μmol·L-1濃度和順鉑 2.5μmol·L-1處理細(xì)胞 24h，研究雙硫侖對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，雙硫侖處理細(xì)胞 24 h 后，4 μmol·L-1組和8 μmol·L-1組均能夠抑制 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的體外遷移，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。結(jié)果表明，雙硫侖能夠抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移（見(jiàn)圖2）。

圖1 雙硫侖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響（x±s，n=6）

圖2 雙硫侖對(duì)SW480結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響（x±s，n=3）

3.3 雙硫侖抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲

選取了對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響的雙硫侖4μmol·L-1和 8 μmol·L-1濃度，處理細(xì)胞 24 h，研究雙硫侖對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，雙硫侖 4μmol·L-1組和 8μmol·L-1組均抑制 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲，且與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明雙硫侖能夠抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲（見(jiàn)圖 3）。

圖3 雙硫侖對(duì)SW480細(xì)胞侵襲的影響（x±s，n=3）

3.4 雙硫侖對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用

裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙硫侖20 mg·kg-1組和40 mg·kg-1組均能減少SW480裸鼠皮下移植瘤的體積和瘤重，且與模型組相比具有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果表明，雙硫侖能夠抑制SW480裸鼠皮下移植瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)（見(jiàn)圖4）。

3.5 雙硫侖對(duì)GLUT1、HIF-1α因子表達(dá)的影響

結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)極為迅速，因此伴隨著HIF-1α高表達(dá)，同時(shí)HIF-1α能夠促進(jìn)結(jié)腸癌組織GLUT1表達(dá)增加，以促進(jìn)腫瘤糖攝取和能量代謝[9]，因此采用免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中的HIF-1α和GLUT1表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在裸鼠移植瘤組織中，雙硫侖 20 mg·kg-1和 40 mg·kg-1均能夠降低 HIF-1α和GLUT1的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙硫侖可能通過(guò)下調(diào)HIF-1α和GLUT1蛋白的表達(dá)，起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用（見(jiàn)圖5）。

圖4 雙硫侖對(duì)SW480細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)的影響，n=6）

4 討 論

雙硫侖是一種臨床廣泛使用的戒酒藥物，鑒于其具有安全無(wú)毒且潛在的抗腫瘤作用，使得對(duì)于研究雙硫侖的抗結(jié)腸癌作用及揭示其作用機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的抗結(jié)腸癌化療藥物具有重要的意義。殷文靜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用雙硫侖單用或者聯(lián)合順鉑共用，均具有促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的作用，表明雙硫侖具有潛在的抗癌價(jià)值。因此本研究對(duì)雙硫侖抗結(jié)腸癌的作用及機(jī)制進(jìn)行初步探索，并采用順鉑作為陽(yáng)性藥進(jìn)行比較。

圖5 雙硫侖對(duì)SW480細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤HIF-1α、GLUT1的影響（x±s，n=6）

本研究表明，單獨(dú)使用雙硫侖能夠明顯抑制體外SW480結(jié)腸癌細(xì)胞和體內(nèi)移植瘤的增殖和生長(zhǎng)，24 h 和 48 h 的 IC50分別為 42.12 μmol·L-1和 33.77 μmol·L-1，同時(shí)雙硫侖能夠抑制SW480細(xì)胞體外遷移和侵襲能力，其抑制作用與順鉑相近。鑒于結(jié)腸癌具有增殖迅速、能量代謝旺盛等特點(diǎn)，因而選取了缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1[11]和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1[12]對(duì)雙硫侖抑制SW480細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機(jī)制進(jìn)行探討。研究已表明，腫瘤細(xì)胞最主要的特征是失控性生長(zhǎng)，急劇生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞對(duì)于氧和糖的需求極其旺盛，為了維持其自身生長(zhǎng)和增殖，則會(huì)調(diào)控一系列分子生物學(xué)反應(yīng)來(lái)維持對(duì)氧和糖的獲取。HIF-1是一種腫瘤組織細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)控因子，能在缺氧狀態(tài)下維持細(xì)胞氧的穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也能夠通過(guò)HIF-1促進(jìn)下游的GLUT1蛋白表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞葡萄糖的攝入，維持其能量代謝水平，進(jìn)而促進(jìn)增殖、生長(zhǎng)、遷移和侵襲。因而開(kāi)展腫瘤細(xì)胞和組織中的HIF-1和GLUT1蛋白表達(dá)的研究，對(duì)于揭示雙硫侖抗腫瘤的作用顯得尤為重要。免疫組化結(jié)果表明，模型組結(jié)腸癌移植瘤組織中HIF-1和GLUT1蛋白水平相對(duì)較高，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，而給予雙硫侖治療后移植瘤中的HIF-1和GLUT1蛋白水平明顯降低，表明雙硫侖可能通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)HIF-1和GLUT1蛋白水平，調(diào)控細(xì)胞能量代謝，從而起到抗結(jié)腸癌的作用。

綜上所述，雙硫侖能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、遷移和侵襲，并發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞HIF-1和GLUT-1蛋白表達(dá)水平、調(diào)控能量代謝有關(guān)，這也提示下一步實(shí)驗(yàn)將采用基因敲除等方式來(lái)研究雙硫侖抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制。本研究表明，雙硫侖是一個(gè)具有潛在研究?jī)r(jià)值的抗腫瘤藥物，具有較好的研發(fā)前景。