楊 玉，周歡娣,2，薛曉英，張 歌，韓雪濤，田哲森，李月紅

1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050000；

2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院中心實驗室，河北 石家莊 050000；

3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050000

食管癌是常見消化道惡性腫瘤，并且是預后較差的消化道惡性腫瘤之一，其術后5年生存率僅為28.5%～57.0%，放療是其主要治療手段之一［1-3］。放射抗性作為腫瘤放療失敗的主要原因，同時也是食管癌放射生物學研究的焦點，對其分子機制的研究備受關注。放射抗性涉及凋亡基因的調(diào)控、DNA損傷修復能力［4］、乏氧［5-6］、細胞周期狀態(tài)［4］及多種分子信號通路的改變［7］。

神經(jīng)營養(yǎng)因子受體相互作用M AGE 類藥物（neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog，NRAGE）是黑色素瘤相關抗原家族的成員［8］。NRAGE基因最初被認為系抑癌基因在細胞存活、凋亡、細胞周期和分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能［9］。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)NRAGE在黑色素瘤、胃癌、結腸癌等癌組織中過表達，并存在與抑癌基因截然相反的作用［10-11］。

有研究發(fā)現(xiàn)，NRAGE在食管癌放射抗拒細胞系TE13R120中表達升高［12］，進一步研究提示NRAGE亞細胞定位變化可能參與食管癌細胞放射抗性的形成［12］。本研究在此基礎上建立NRAGE基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的食管癌細胞系，觀察其對細胞放射抗性、細胞周期和凋亡的影響，探討其參與放射抗性的可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系及主要試劑

人食管鱗狀細胞癌細胞株Eca109為北京大學高獻書教授實驗室惠贈，質(zhì)粒為河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院放療科實驗室保存，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司（貨號：11668027），G418購自美國Sigma公司（貨號：11811023），NRAGE（貨號：22053-1-AP）和β-catenin（貨號：51067-2-AP）多克隆抗體均購自美國Proteintech公司，引物設計由上海捷瑞生物工程有限公司完成，PrimeScriptTMⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR047A）與SYBR PremixEx TaqTM（貨號：RR820A）均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（貨號：CA1020），流式細胞儀購自美國BD公司（型號：FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

①篩選濃度的確定：接種Eca109于6孔板上，5×103個/孔，培養(yǎng)24 h后，按100～1000 μg/mL濃度范圍加入G418，繼續(xù)培養(yǎng)。維持上述G418濃度，正常換液，觀察細胞的生長和凋亡情況，兩周后使全部細胞死亡的最低濃度即為最佳篩選濃度。② 轉(zhuǎn)染及篩選：參照LipofectamineTM2000說明書，取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板上，當細胞長至80%～90%融合時，轉(zhuǎn)染，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h換完全培養(yǎng)基。實驗分為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組（Eca109/NRAGE組）和對照組（Eca109組）。全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按1∶6傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換G418的全培養(yǎng)基進行抗性篩選。當有大量細胞死亡時把抗生素濃度減半維持篩選，兩周后，Eca109組細胞全部死亡，Eca109/NRAGE組細胞有克隆形成，挑取陽性克隆，擴大培養(yǎng)，以備實驗用。③單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取總RNA和總蛋白做實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitive polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）與蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)效果。

1.2.3 細胞照射條件

輻照設備為電子直線加速器［醫(yī)科達（上海）醫(yī)療器械有限公司］，使用6 MV X射線進行照射，劑量率為300 MU/min，機架角為180度，SSD源皮距為100 cm，并在培養(yǎng)瓶下放置1.5 cm組織補償膜，室溫下照射。

1.2.4 RTFQ-PCR檢測NRAGE和β-catenin mRNA表達

收集細胞，利用TRIzol試劑提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，再按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒的操作步驟，以GAPDH作為內(nèi)參。擴增條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性5 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。采用相對定量法比較目的mRNA的表達差異，以2-（Ct目的基因-Ct GAPDH）作為目的基因mRNA相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測相關蛋白水平

根據(jù)試劑盒說明書提取細胞總蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（NRAGE為1∶100，β-catenin為1∶1000，β-actin為1∶500），4 ℃搖床一抗封閉過夜。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000）于37 ℃搖床溫育2 h，TBST洗3次，5 min/次，然后洗膜、顯影。β-actin為內(nèi)參。

1.2.6 克隆形成實驗測定放射敏感性

取指數(shù)生長期細胞，將細胞接種于6孔板上，每孔分別接種50、100、300、500、800、1000個細胞。每組設3個平行組，分別照射0、2、4、6、8和10 Gy。培養(yǎng)10～14 d見克隆形成時終止培養(yǎng)。甲醇固定15 min，結晶紫染液染色30 min，計數(shù)集落數(shù)，以≥50個細胞的集落作為一個克隆。存活分數(shù)（survival fraction，SF）=實驗組集落形成率/對照組集落形成率；集落形成率=形成集落數(shù)/種植細胞數(shù)；以單擊多靶模型S=1-（1-e-D/D0）N擬合細胞存活曲線并計算放射生物學參數(shù)D0、Dq、N和SF2（照射2 Gy后細胞SF）。

1.2.7 流式細胞術分析細胞周期和凋亡分布的變化

兩組細胞分別接受10 Gy劑量的單次照射后繼續(xù)培養(yǎng)12 h后檢測細胞周期及凋亡，收集各組細胞2×106個，用PBS洗滌細胞沉淀后離心去上清，用70%冰乙醇4 ℃固定12 h，棄上清，PBS洗滌，加入PI染液后37 ℃溫育后上機分析細胞周期。相同細胞制備方法加入500 μL結合緩沖液懸浮細胞；加入5 μL Annexin-V-FITC混勻，再加入5 μL碘化丙啶混勻，室溫避光反應15 min后上機檢測細胞凋亡。

1.2.8 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數(shù)生長期細胞，2×105個/孔接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h時（T0）在培養(yǎng)板底部“1”字形劃痕，顯微鏡下觀察劃痕并拍照記錄；繼續(xù)培養(yǎng)12、24 h，拍照。用Image J軟件分析數(shù)據(jù)并計算細胞遷移率。遷移率=（T0時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/T0時劃痕寬度×100%。

1.2.9 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力

收集2×104個對數(shù)生長期細胞加入Transwell小室上室，將600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液加入小室下室，培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞和Matrigel基質(zhì)膠。固定后沖洗，顯微鏡（×100）下觀察，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗結果采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，結果以表示，采用t檢驗及方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 過表達NRAGE基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構建

RTFQ-PCR和Western blot結果證實Eca109/NRAGE組細胞的NRAGE表達量較其親本細胞明顯增加（P＜0.05，圖1A、B）。倒置顯微鏡下觀察Eca109和Eca109/NRAGE細胞株，Eca109細胞為圓形或不規(guī)則多邊形，細胞間邊界不清，呈片狀生長；而Eca109/NRAGE細胞株則細長呈梭形或紡錘形，細胞極性消失（圖1C、D）。

圖1 過表達NRAGE基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構建Fig.1 Construction of stable transfected cell line with overexpression of NRAGE gene

2.2 NRAGE對食管癌細胞放射抗性的影響

Eca109/NRAGE細胞的D0、Dq、N、SF2值均增大，其中Eca109/NRAGE細胞的D0、Dq、SF2值顯著高于Eca109細胞，差異有統(tǒng)計學意義（t分別為2.253、2.939、2.351，P＜0.05，圖2，表1）。

表1 單擊多靶模型參數(shù)值Tab.1 The parameter values of survive curves fitted with the multi-target model

圖2 Eca109和Eca109/NRAGE組細胞的放射生存曲線Fig.2 Radiation survival curves of Eca109 and Eca109/NRAGE cells

2.3 NRAGE對細胞周期及凋亡的影響

兩組細胞在照射前，Eca109/NRAGE細胞中S期細胞比例顯著高于Eca109組（t=2.756，P＜0.05），而G2/M期細胞分布低于Eca109組（t=10.5，P＜0.05）。10 Gy的X射線照射后兩組細胞均出現(xiàn)G2/M 期阻滯，表明細胞在進行自身損傷修復，照射后Eca109相比于Eca109/NRAGE組G0/M期細胞比例顯著增加（t=23.78，P＜0.05）。兩組細胞在照射前，Eca109細胞凋亡率為7.99%±0.71%，Eca109/NRAGE細胞凋亡率為4.16%±0.15%。兩組細胞相比，Eca109/NRAGE細胞凋亡率顯著降低（t=3.268，P＜0.05）。10 Gy的X射線照射后兩組細胞凋亡率均增加，Eca109細胞凋亡率為34.63%±2.54%，Eca109/NRAGE細胞凋亡率為24.29%±1.122%。兩組細胞相比，Eca109細胞凋亡率增加更顯著（t=8.829，P＜0.05，圖3）。

圖3 NRAGE對細胞周期及凋亡的影響Fig.3 The influence of NRAGE on cell cycle and cell apoptosis

2.4 NRAGE對細胞遷移和侵襲的影響

采用劃痕實驗觀察NRAGE基因及低劑量照射（5 Gy）對Eca109細胞遷移影響，發(fā)現(xiàn)0 Gy照射時Eca109/NRAGE細胞的劃痕寬度有所變窄，其細胞遷移能力顯著高于Eca109（t=7.729，P＜0.05）。

接受5 Gy照射后Eca109、Eca109/NRAGE細胞的遷移能力均降低（t分別為8.017、3.466，P均＜0.05），且Eca109/NRAGE細胞遷移率仍高于Eca109（t=12.28，P＜0.05）。實驗結果見圖4，統(tǒng)計結果見表2。對于侵襲能力的檢測，0 Gy照射時Eca109/NRAGE細胞侵襲能力顯著高于Eca109（t=11.73，P＜0.05）。接受5 Gy照射后Eca109、Eca109/NRAGE細胞的侵襲能力均降低（t分別為5.857、8.644，P＜0.05），且Eca109/NRAGE培養(yǎng)24 h的細胞穿膜細胞數(shù)高于Eca109（t=8.944，P＜0.05，圖5，表3）。

2.5 Eca109和Eca109/NRAGE細胞中β-catenin表達情況

RTFQ-PCR 和Western blot結果結果顯示，β-catenin在Eca109/NRAGE組細胞中的表達量顯著高于Eca109組細胞（P＜0.05，圖6）。

圖4 NRAGE對細胞遷移的影響Fig.4 The influence of NRAGE on cell migration

表2 NRAGE對細胞遷移的影響Tab.2 The influence of NRAGE on cell migration

圖5 NRAGE對細胞侵襲的影響Fig.5 The influence of NRAGE on cell invasion

表3 NRAGE對細胞侵襲的影響Tab.3 The influence of NRAGE on cell invasion

圖6 Eca109和Eca109/NRAGE細胞中β-catenin表達Fig.6 The β-catenin expression in Eca109 and Eca109/NRAGE cells

3 討論

食管癌是常見的上皮組織源性的惡性腫瘤，中國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，在中國十大惡性腫瘤死亡率中，食管癌死亡率占第四位［14］。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦，放療和手術一樣是食管癌主要的根治手段。雖然放射物理學技術不斷提高，已經(jīng)顯著提高了食管癌放療的精度，但食管癌患者5年生存率仍不足20%［15］。治療失敗的主要失敗原因為局部復發(fā)，進一步研究發(fā)現(xiàn)主要與放療期間腫瘤細胞獲得放射抗性有關［16］。隨著放射抗性研究的不斷深入，從細胞生物學角度探索癌細胞放射抵抗的分子機制，改善腫瘤的放射敏感性，將為提高食管癌局部控制率，改善預后提供幫助，對于制定腫瘤治療方案起到重要作用。

本課題組前期利用食管鱗癌細胞TE13，經(jīng)X線反復照射得到了具有放射抗拒性且能夠穩(wěn)定遺傳的細胞株TE13R120。通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在食管癌放射抗性細胞TE13R120中，NRAGE表達顯著升高，且實驗證實，NRAGE表達量在兩種細胞中隨照射后時間的延長和照射劑量的增加而升高［12］，提示該基因可能參與放射抗性的形成。后續(xù)在探索可能的作用機制時發(fā)現(xiàn)，NRAGE亞細胞定位變化可能參與食管癌細胞放射抗性的形成［13，17-18］。

本實驗通過基因轉(zhuǎn)染的方法構建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NRAGE基因的食管癌細胞Eca109/NRAGE，經(jīng)克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后的Eca109/NRAGE細胞具有明顯的放射抗拒性，進一步證實NRAGE參與了介導食管癌放射抗性的形成。至此，NRAGE影響放射抗性的關系得到確定。

另外，我們檢測了兩組細胞在放射前后細胞周期和細胞凋亡的變化。結果顯示，與Eca109細胞相比，Eca109/NRAGE細胞對射線抵抗性最強的S期細胞比例增加而對射線最敏感的G2/M期減少；X射線照射后，Eca109細胞G2/M期細胞分布的增加較過表達細胞更為顯著，證實NRAGE高表達與食管癌細胞放射抗性密切相關。該結果也表明該基因可能通過影響細胞周期分布，進而參與細胞放射抗性形成。Yang等［9］在對食管癌細胞研究中發(fā)現(xiàn)，敲低NRAGE基因可引起細胞周期的改變，出現(xiàn)G2/M期阻滯現(xiàn)象，且S期細胞明顯減少，與本研究結果一致。與Eca109組細胞相比，Eca109/NRAGE細胞凋亡率明顯降低，X射線照射后兩組細胞凋亡率均增加，但Eca109細胞凋亡率的增加更為顯著（P＜0.05），表明該基因抑制細胞凋亡，進而參與細胞放射抗性形成。Kumar等［11］研究發(fā)現(xiàn)，NRAGE在肺癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，本研究結果與上述報道一致。

細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示，NRAGE的過表達可以增強細胞的遷移和侵襲能力，Jiang［20］等對胃癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，敲低NRAGE基因表達可以抑制細胞的侵襲能力。

經(jīng)典Wnt通路與腫瘤放射抗性形成密切相關，成為近年來的研究熱點。Chu等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在PANC-1細胞中敲低NRAGE基因可以使β-catenin與上皮標志物E-cadherin表達降低，進而抑制胰腺癌和惡性黑色素瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此本研究檢測在食管癌細胞中NRAGE是否通過激活β-catenin發(fā)揮功能。本研究結果顯示，β-catenin在Eca109/NRAGE組細胞的表達量較其親本細胞明顯增高。初步證實在Eca109/NRAGE組細胞中高表達的NRAGE可能通過參與Wnt/β-catenin信號通路而參與放射抗性的形成。

綜上所述，本研究成功建立了穩(wěn)定表達NRAGE的食管癌細胞系，并初步觀察外源性NRAGE對細胞體外放射抗性的影響，并對其放射抵抗機制進行初步探索，希望為今后利用NRAGE基因治療食管癌的研究提供細胞模型及實驗依據(jù)，為提高放療敏感性尋找新的靶點。