龔林，趙靖悅，雷娜娜，胡榮飛，陳由強(qiáng)，薛婷，何文錦

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院海洋生物醫(yī)藥與制品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院福建省微藻種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350117）

植物在生長發(fā)育過程中，會受到各種環(huán)境條件的影響，其中光的影響至關(guān)重要。光對植物的作用有兩方面：一方面是給植物進(jìn)行光合作用提供必不可少的能量，另一方面可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，即光形態(tài)建成或光控發(fā)育[1]。在植物光形態(tài)建成過程中感受光信號的物質(zhì)是光受體，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)植物主要有2種光受體：一是紅光受體，即光敏色素(phytochrome)，接受紅光或遠(yuǎn)紅光；二是藍(lán)光受體，接受藍(lán)光或紫光，而藍(lán)光受體包含隱花色素(cryptochrome)和向光素(phototropin)兩種[2]。

隱花色素存在于細(xì)菌、植物、動物和人體內(nèi)，分為3類：動物隱花色素、植物隱花色素和DASH隱花色素。有研究表明，除了DASH隱花色素具有修復(fù)單鏈DNA的功能[3]之外，其它隱花色素都沒有DNA修復(fù)功能。在Cry1和Cry2的C端包含一個可變區(qū)域，即功能區(qū)域；N端有2種分子，一個是甲基四氫葉酸MTHF，另一個是FAD[4]。Cry1和Cry2主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，是一類吸收藍(lán)光(400～500 nm)和近紫外光(320～400 nm)的光受體，在藍(lán)紫光區(qū)有3個吸收峰(通常在450、420、480 nm左右)，在近紫外光區(qū)有1個吸收峰(通常在370～380 nm），不同植物對藍(lán)光效應(yīng)的作用光譜稍有差異。經(jīng)過長期研究，現(xiàn)己知隱花色素在植物種子萌發(fā)中起去黃化作用，光周期誘導(dǎo)開花和起調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律作用[5]。

藍(lán)光對藻類生長發(fā)育及代謝物生成積累影響機(jī)制的相關(guān)研究不斷深入。有研究表明，藍(lán)光可調(diào)控萊茵衣藻的細(xì)胞周期循環(huán)、節(jié)律、葉綠素及類胡蘿卜素合成等相關(guān)生理過程[6]；藍(lán)光可以有效誘導(dǎo)雨生紅球藻蝦青素的合成與積累，對雨生紅球藻蝦青合成積累具有重要影響[7]。隱花色素結(jié)構(gòu)與功能在微藻中研究日漸深入，目前在模式微藻三角褐指藻、萊茵衣藻和金駝球藻中均有相關(guān)研究和報道[8～10]。球等鞭金藻近緣物種海洋球石藻等物種隱花色素基因在NCBI數(shù)據(jù)庫上已有發(fā)表，但是球等鞭金藻隱花色素基因功能與結(jié)構(gòu)等方面研究尚未見報道，其基因組數(shù)據(jù)庫也尚未發(fā)表。

本研究以球等鞭金藻為材料，在實驗室建立的球等鞭金藻基因組數(shù)據(jù)庫中查找出一條隱花色素基因——Cryl-like，通過PCR獲取該基因DNA全長、重疊延伸PCR獲取其cDNA全長。對Cryl-like基因進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二三級結(jié)構(gòu)等相關(guān)生物信息學(xué)分析，為后續(xù)探討球等鞭金藻中隱花色素響應(yīng)藍(lán)光機(jī)制提供理論依據(jù)，為隱花色素參與球等鞭金藻光響應(yīng)機(jī)制等方面的功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)藻種來源于上海光語生物科技有限公司。培養(yǎng)周期為光∶暗=12h∶12h，光照強(qiáng)度3500 lux，溫度18 ℃，培養(yǎng)于錐形瓶中。培養(yǎng)基采用f/2 培養(yǎng)基[11]。

HiFi Taq DNA聚合酶、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TransGen；pMD 19-T載體購自Takara；膠回收試劑盒購自Tiangen；氨芐青霉素(Amp)購自上海生物工程公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因序列獲取

利用NCBI數(shù)據(jù)庫上擬南芥隱花色素基因蛋白序列，與本實驗室建立的球等鞭金藻基因組數(shù)據(jù)庫中比對找出同源序列Cryl-like基因蛋白序列。再從球等鞭金藻基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分別查找出Cryl-like基因DNA和cDNA序列，其中DNA序列全長2913 bp，cDNA序列全長2316 bp。

1.2.2 基因組DNA、RNA的提取

取培養(yǎng)2周處于對數(shù)生長期的球等鞭金藻藻液，參照微藻CTAB法[11]提取基因組總DNA?？俁NA的提取參照Trizol說明書。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA、RNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定濃度。

1.2.3 PCR反應(yīng)

利用引物設(shè)計軟件primer5設(shè)計球等鞭金藻Cryl-like基因DNA、cDNA全長序列特異性引物，引物由上海生工生物公司合成。5'端引物（F）：5'-ATGCGTGTCGAGCTTTTCGTG-3'；3'端引物（R):5'-TCAGCGCATATACTTCTTTATGCTG-3'。

PCR反應(yīng)體系為50 uL(含10×buffer 5 uL，dNTP Mixture[each 2.5 mmol/L]4ul，GC enhancer 5 ul，上下游引物各2 ul，DNA或cDNA模板1 uL， HiFi Taq酶0.4 uL，加適量滅菌超純水到50 ul)。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物取2 ul，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收。

1.2.4 目的基因片段的克隆及測序

采用Tiangen膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，隨后將回收產(chǎn)物與pMD-19t載體進(jìn)行16 ℃過夜連接，連接酶選用Ligation Solution I。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于帶有氨芐青霉素抗性瓊脂平板。通過菌液PCR篩選出陽性克隆，陽性克隆搖菌過夜再提取質(zhì)粒送測序公司測序。

1.2.5 序列生物信息學(xué)分析主要運(yùn)用的生信分析軟件和網(wǎng)站

蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)和分子量的計算使用ExPASy的ProtParam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）；

蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測采用SignalP 4.0在線網(wǎng)站（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）；

蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測采用NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測采用Cell-PLoc 2.0 的Euk-mPLoc 2.0在線程序分析(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)；

蛋白質(zhì)功能預(yù)測采用ExPASy主頁上的Interpro在線程序（https://www.ebi.ac.uk/interpro/beta/）

蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分別采用ExPASy的SOPMA程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISSMODEL程序（https://swissmodel.expasy.org/）；

蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)；

同源序列查找使用NCBI的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；

蛋白質(zhì)同源序列比對采用Clustalx軟件，比對結(jié)果優(yōu)化使用DANman軟件；

MEGA7 軟件以最大似然法（Maximum likelihood）構(gòu)建進(jìn)化樹，分支置信度經(jīng)1000次自舉重復(fù)測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 以球等鞭金藻基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以球等鞭金藻基因組DNA為模板對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測，與 5000 bp Ladder Marker進(jìn)行比較，可見擴(kuò)增片段約為3000 bp，與Cryl-like基因組DNA序列大小吻合，見圖1。

2.2 PMD19-T克隆后檢測結(jié)果

PMD19-T載體大小為2692 bp，與片段大小為2916 bp的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接后重組質(zhì)粒大小約為5700 bp。PMD19-T與Cryl-like基因重組質(zhì)粒（下文稱PMD-Cry1-like質(zhì)粒）凝膠電泳圖顯示重組質(zhì)粒片段大小與預(yù)期一致（圖2）， 基因成功連接至PMD19-T質(zhì)粒上。將PMD-Cry1-like質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果與球等鞭金藻Cryl-likeDNA全長序列比對，兩者序列一致，通過PCR方式順利克隆得到CryllikeDNA全長。

2.3 重疊延伸PCR獲取Cryl-like基因cDNA全長

表1 重疊延伸PCR各分段引物

以球等鞭金藻cDNA為模板對 C ry1-like 基因cDNA全長進(jìn)行多次PCR無果，隨后采用重疊延伸PCR。利用NCBI網(wǎng)站上的splign程序在線對比DNA和cDNA全長序列，找出Cryl-like基因內(nèi)含子和外顯子各分段序列，見圖3。依據(jù)圖3顯示的Cryl-like各分段序列，設(shè)計5'-3'端特異性引物，各分段引物如表1所示。

PCR反應(yīng)條件同1.2.3，模板為PMD-Cry1-like質(zhì)粒。將Cryl-like外顯子分段1、2、3分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳，結(jié)果顯示各分段PCR產(chǎn)物條帶大小合適（圖4）。將分段1、分段2 PCR回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊延伸PCR獲得分段1+2片段，再以分段1+2和分段3的回收產(chǎn)物為模板用全長引物進(jìn)行PCR，從而獲得Cryl-like基因cDNA全長。連接Cryl-like基因cDNA序列一致，說明成功克隆得到球等鞭金藻Cryl-like基因cDNA全長。

2.4 球等鞭金藻Cryl-like基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 球等鞭金藻Cry1-like蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與功能預(yù)測

使用Protparam在線程序分析Cry1-like蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為8.95，分子式推測為C3791H5996N1090O1102S30，蛋白質(zhì)分子量為85437.75 Da。不穩(wěn)定指數(shù)為46.29，推測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。預(yù)測在酵母中表達(dá)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌中表達(dá)的半衰期大于l0 h，而在哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞中體外培養(yǎng)表達(dá)的半衰期為30 h。該蛋白由20種基本氨基酸組成，含量較高的氨基酸殘基是丙氨酸（Ala，11.8%）和亮氨酸（Leu，11.0%），含量較低的氨基酸殘基是半胱氨酸（Cys，1.6%）和組氨酸（His，1.9%）。其帶正電荷氨基酸有89個(Asp+Glu)，帶負(fù)電荷的氨基酸有100個(Arg + Lys)。經(jīng)過protscale程序在線分析，氨基酸序列疏水性/親水性預(yù)測結(jié)果表明，平均疏水性系數(shù)為-0.269，小于0，推測其為親水性蛋白，其脂肪系數(shù)為84.37。TMHMM在線程序預(yù)測Cry1-like無跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP 4.0預(yù)測Cry1-like蛋白不存在信號肽結(jié)構(gòu)。NetPhos預(yù)測Cry1-like蛋白可能存在磷酸化位點(diǎn)有72個，如圖6所示，其中絲氨酸（Serine）有47個，蘇氨酸有（Threonine）18個，絡(luò)氨酸（Threshold）有7個。Euk-mPLoc 2.0預(yù)測Cry1-like蛋白定位于細(xì)胞核。利用Interproscan對其蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果顯示球等鞭金藻Cry1-like歸屬于Cryptochrome/DNA photolyase class1家族。

2.4.2 二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站上SOPMA在線程序預(yù)測球等鞭金藻 Cry1-like基因二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該基因主要存在α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)。α-螺旋占比例最高的為約為43.06%，無規(guī)則卷曲約為37.35%，延伸鏈約為11.93%，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最少僅為7.65%。采用SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，如圖7所示，Cry1-like基因編碼的蛋白三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)相符，N端區(qū)域主要有含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角組成，C端區(qū)域主要由無規(guī)則卷曲組成。

2.4.3 球等鞭金藻Cry1-like基因保守域分析

通過PCR得到Cry1-like基因全長cDNA后，將序列提交至NCBI網(wǎng)站CDD數(shù)據(jù)庫對該基因的保守域進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因存在多個隱花色素家族基因結(jié)構(gòu)的保守域，如8-羧基-7,8二脫甲基-5-脫氮核黃素（8HDF）、甲基四氫葉酸(MTHF)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等[12]，并且Cry1-like基因含有上述三個保守域結(jié)構(gòu)均較為完整（圖8）。由此可以初步證實，球等鞭金藻Cry1-like基因?qū)儆陔[花色素家族基因成員。

2.4.4 氨基酸序列同源性比對及序列進(jìn)化分析

采用NCBI中的BlastP在線程序查找 Cry1-like的同源氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻Cry1-like氨基酸序列與多個微藻隱花色素相關(guān)氨基酸序列同源性較高，其中有海洋球石藻（Emiliania huxleyi CCMP1516）EhCRY1（XP_005777116.1）、金藻屬Chrysochromulina sp.CCMP291 hypothetical protein Ctob_011767（KOO26762.1）、藍(lán)隱藻（Guillardia theta CCMP2712） hypothetical protein GUITHDRAFT_137315 （XP_005834512.1）、綠藻屬Raphidocelis subcapitata hypothetical protein Rsub_10233(GBF97878.1) 、圓柱擬脆桿藻（Fragilariopsis cylindrus CCMP1102）FcCPD2（OEU23746.1），這五條氨基酸序列與Cry1-like氨基酸序列同源性分別為61.83%、58.90%、56.15%、53.11%、43.87%。此外， 球等鞭金藻Cry1-like與近緣物種海洋球石藻CRY1的氨基酸序列相似性高達(dá)95%。采用Clustalx軟件進(jìn)行序列同源性比對分析，比對結(jié)果經(jīng)DNAman軟件優(yōu)化處理。結(jié)果顯示，球等鞭金藻Cry1-like氨基酸序列與上述幾個微藻隱花色素基因的氨基酸序列明顯存在多處保守區(qū)域。

2.4.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從NCBI上數(shù)據(jù)庫中下載模式植物擬南芥、模式微藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum CCAP）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和金駝球藻（Ostreococcus tauri），以及海洋球石藻等物種隱花色素基因氨基酸序列，與球等鞭金藻Cryl-like基因氨基酸序列進(jìn)行序列比對后采用最大似然法（Maximum likelihood）法構(gòu)建進(jìn)化樹（圖10）。從進(jìn)化樹上看，Cryl-like基因與海洋球石藻Cry1，金駝球藻CPD1，小球藻CPD1，擬南芥Cry1和Cry2處于同一分支上，序列之間親緣關(guān)系最為接近，進(jìn)一步證實Cryl-like基因是球等鞭金藻的Cry1基因。

3 小結(jié)與討論

本研究從課題組最新構(gòu)建好的球等鞭金藻基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中查找出Cryl-like基因，通過分子生物學(xué)方法克隆出球等鞭金藻隱花色素Cryl-like基因DNA和cDNA全長，并對其采用了理化性質(zhì)分析、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、二三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、同源序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建等多種生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析。通過分析，得知該基因DNA全長2916 bp、cDNA全長為2613 bp，編碼771個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為8.95，預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為85437.75 Da，且為不穩(wěn)定蛋白。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)域含有隱花色素基因家族都有的2個結(jié)構(gòu)域：DNA光裂解酶結(jié)構(gòu)域、FAD結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，初步證實Cryl-like基因?qū)儆谇虻缺藿鹪咫[花色素基因家族成員。氨基酸序列同源性比對及序列進(jìn)化分析，Cryl-like基因與近緣物種海洋球石藻中的Cry1基因最為相似，并且球等鞭金藻與海洋球石藻都屬于金藻成員，因此預(yù)測Cryl-like基因是球等鞭金藻中的Cry1基因。

近年來，光信號引發(fā)的微藻光響應(yīng)機(jī)制成為微藻光生物學(xué)研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。真核微藻中藍(lán)光受體基因克隆、蛋白結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化、光化學(xué)特性、生理功能及光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究不斷開展，取得了許多新的突破性進(jìn)展[13，14]。目前研究發(fā)現(xiàn)動物隱花色素、植物隱花色素和DASH隱花色素三類隱花色素在綠藻、紅藻、硅藻等微藻中均廣泛存在。球等鞭金藻作為常見的海洋微藻，富含EPA、DHA和類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)[15]，這些代謝物質(zhì)生成積累與球等鞭金藻光響應(yīng)機(jī)制發(fā)揮作用密不可分，而隱花色素在其過程中能起何作用和其中的機(jī)制原理都值得深入研究。本實驗克隆得到球等鞭金藻Cryl-like基因，為后續(xù)隱花色素基因家族結(jié)構(gòu)與功能及其對藍(lán)光光響應(yīng)機(jī)制研究提供了依據(jù)。