常藝馨, 包國章, 張夢瑜

(吉林大學(xué) 新能源與環(huán)境學(xué)院, 長春 130012)

黑麥(SecalecerealeL.)為越年生草本植物, 主要分布于我國北部地區(qū), 葉片營養(yǎng)豐富、 產(chǎn)量較高, 是具有較高飼用價(jià)值的優(yōu)質(zhì)牧草[1].冬牧70黑麥草具有較強(qiáng)的抗寒能力, 在0.5～2.5 ℃也可出苗, 適合北方地區(qū)種植[2].我國東北地區(qū)冬季與春季交替時(shí)溫度較低, 時(shí)常發(fā)生凍融現(xiàn)象, 溫度大幅度波動影響植物生長, 持續(xù)低溫脅迫導(dǎo)致植物組織損傷或死亡[3].干旱也是植物生長時(shí)面臨的一種災(zāi)害, 干旱頻發(fā)會影響植物的正常生長發(fā)育[4-5].目前人們對單一脅迫的研究較多, 但凍融和干旱兩種脅迫常伴隨發(fā)生, 其復(fù)合脅迫的研究結(jié)果文獻(xiàn)報(bào)道較少, 因此了解凍融及干旱復(fù)合脅迫下植物的生理特性極為重要[6].本文研究干旱及凍融脅迫下冬牧70黑麥草體內(nèi)抗氧化酶活性與脯氨酸變化及其因子間的相關(guān)性, 分析牧草在逆境中的抗旱和抗寒性.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

選用冬牧70黑麥草種子為實(shí)驗(yàn)材料.先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的KMnO4溶液浸泡消毒10 min, 再用去離子水沖洗, 平鋪在含有濕濾紙的托盤中, 蓋上保鮮膜培養(yǎng), 加入適量Hoagland營養(yǎng)液, 在光照培養(yǎng)箱內(nèi)(MGC-450BP型, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)培養(yǎng).模擬室外生長環(huán)境, 設(shè)定為白天25 ℃, 夜晚20 ℃, 光照12 h, 光照強(qiáng)度(PPFD)約為280 μmol/(m2·s)(60%), 適當(dāng)通風(fēng), 每天用Hoagland營養(yǎng)液補(bǔ)充水分, 培養(yǎng)7 d后進(jìn)行模擬干旱及凍融處理.

1.1.1 干旱處理 用Hoagland營養(yǎng)液配制聚乙二醇(PEG)溶液, 選用PEG體積分?jǐn)?shù)為5%(輕度干旱, D1)、 10%(中度干旱, D2)、 15%(重度干旱, D3)三種程度, CK組為對照組.選取長勢相同的黑麥草幼苗, 分別進(jìn)行輕度、 中度和重度干旱處理, 處理時(shí)間為2 d.

1.1.2 凍融處理 干旱處理2 d后, 將幼苗放入控溫(交變)試驗(yàn)箱(BPHJ-120A型, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中進(jìn)行1次凍融脅迫處理, 凍融溫度在程控下逐漸變溫, 周期為14 h, 每2 h取樣一次, 凍融取樣時(shí)的溫度分別為10,5,0,-5,0,5,10 ℃(分別記為T1～T7).實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)處理組：F(凍融組)；D1+F(輕度干旱凍融組)；D2+F(中度干旱凍融組)；D3+F(重度干旱凍融組).在每個(gè)溫度下, 4個(gè)處理組均隨機(jī)取樣, 設(shè)置3個(gè)重復(fù).實(shí)驗(yàn)處理方法列于表1.

表1 實(shí)驗(yàn)處理方法

注：+加凍融; -不加凍融.

1.2 指標(biāo)測定

用南京建成公司生產(chǎn)的SOD試劑盒和POD試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活性[7], 用酸性茚三酮法測定脯氨酸的質(zhì)量比[8].

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2007和SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和單因素方差分析(ANOVA), 用最小顯著差異法在P=0.05顯著性水平上進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn), Pearson相關(guān)系數(shù)表示相關(guān)性, 用Origin8.0軟件制圖.所有結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱及凍融脅迫對酶活性的影響

2.1.1 對SOD活性的影響 干旱及凍融脅迫對幼苗中SOD活性的影響如圖1所示.由圖1可見: 干旱脅迫下的各組幼苗葉片中SOD活性均有所增加, 與對照組相比分別上升了8.3%,12.6%,6.2%(P<0.05); 凍融處理下的葉片中SOD活性均呈先升高后緩慢下降趨勢, 在T1～T4的溫度下降階段, 葉片中SOD活性呈上升趨勢, 在-5 ℃出現(xiàn)最大值, SOD活性最高與其他溫度組均存在顯著性差異(P<0.05), 在T4～T7的溫度上升階段, SOD活性呈下降趨勢; 當(dāng)溫度恢復(fù)到10 ℃時(shí), F組與對照組相比其SOD活性上升了11.1%, 復(fù)合脅迫D1+F和D2+F組分別上升了2.3%,18.6%, D3+F組下降了11%.

2.1.2 對POD活性的影響 圖2為干旱及凍融脅迫對幼苗葉片中POD活性的影響.由圖2可見：干旱脅迫下的葉片POD活性呈上升趨勢, 與對照組相比分別增加了24.3%,36.1%,29.2%(P<0.05); 在凍融處理階段, 單凍融與復(fù)合脅迫組葉片中POD活性呈先升高后緩慢下降趨勢, 在T1～T4的溫度下降階段, 幼苗中的POD活性逐漸升高, 在-5 ℃時(shí)幼苗的POD活性最高, 在T4～T7的溫度上升階段, 幼苗中的POD活性緩慢下降; 當(dāng)溫度恢復(fù)到10 ℃時(shí), 各組的POD活性順序?yàn)? D2+F>D1+F>F>D3+F>CK, F與對照組相比上升了47.3%, 復(fù)合脅迫下D1+F,D2+F,D3+F組其活性分別升高了54.4%,76.8%,40.2%(P<0.05), D2+F組葉片中POD活性最顯著.

a,b,c,d表示同一溫度下不同處理組有顯著性差異(P<0.05).數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n=3).

a,b,c,d,e表示同一溫度下不同處理組有顯著性差異(P<0.05).數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n=3).

SOD和POD是植物體內(nèi)重要的細(xì)胞保護(hù)酶防御系統(tǒng)[9].逆境時(shí)植物體內(nèi)會產(chǎn)生活性氧(ROS)且代謝發(fā)生紊亂, ROS引起氧化應(yīng)激會導(dǎo)致生物膜過氧化等傷害[10-11].在單一干旱、 凍融脅迫及復(fù)合脅迫下, SOD和POD活性均顯著增加并高于CK組, 且復(fù)合脅迫高于單一脅迫, 與文獻(xiàn)[12]結(jié)果相符.這可能是由于干旱及凍融脅迫下的膜脂過氧化作用, 誘導(dǎo)SOD活性增強(qiáng), 將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2, H2O2積累誘導(dǎo)POD活性增強(qiáng), POD將H2O2分解, 防止H2O2與剩余超氧陰離子反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的OH-, 加劇氧化脅迫, 從而達(dá)到維護(hù)機(jī)體免受活性氧的損傷[13].干旱脅迫下, 隨著干旱程度的增加, 葉片中酶活性不斷增加, 與文獻(xiàn)[14]對芒草的研究結(jié)果相同.凍融脅迫下, 在-5 ℃時(shí)幼苗葉片酶活性出現(xiàn)峰值.這可能是由于黑麥草細(xì)胞受低溫刺激, 體內(nèi)的酶活性提高, 降低細(xì)胞冰點(diǎn)以防止植物在低溫?fù)p傷所致[15].復(fù)合脅迫下, 葉片由于受持續(xù)干旱及低溫傷害, 當(dāng)溫度恢復(fù)時(shí), SOD和POD活性略有恢復(fù), 但與CK組相比仍較高, 雖然溫度得到補(bǔ)償, 但幼苗仍受嚴(yán)重脅迫, 抗逆性作用下誘導(dǎo)SOD和POD活性增強(qiáng)[16-17].其中D2+F組幼苗的SOD和POD活性恢復(fù)顯著且小于單一凍融組.

2.2 干旱及凍融脅迫對脯氨酸質(zhì)量比的影響

a,b,c,d,e表示同一溫度下不同處理組有顯著性差異(P<0.05).數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n=3).

圖3為不同程度干旱脅迫及凍融脅迫對幼苗葉片中脯氨酸質(zhì)量比的影響.由圖3可見: 在單一干旱脅迫下, D1,D2,D3組脯氨酸的質(zhì)量比均顯著增加, 與對照組相比分別增加了26.2%,48.2%,66.6%(P<0.05); 在凍融脅迫下, 各處理組脯氨酸的質(zhì)量比呈先升高再緩慢下降趨勢, 在T1～T4的溫度下降階段, 各處理組脯氨酸的質(zhì)量比均逐漸升高, 在-5 ℃出現(xiàn)最大值, 具有顯著性差異, 在T4～T7的溫度上升階段, 脯氨酸的質(zhì)量比呈下降趨勢, 當(dāng)溫度恢復(fù)到10 ℃時(shí), F組與對照組相比上升了68.4%；復(fù)合脅迫下D1+F,D2+F,D3+F組的脯氨酸質(zhì)量比分別升高了60.5%,95.8%,57.4%(P<0.05), 其中D2+F組幼苗中脯氨酸的質(zhì)量比最高.

脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一, 植物通過增大其含量提高對滲透脅迫的適應(yīng)能力[16].干旱脅迫導(dǎo)致脯氨酸質(zhì)量比增大, 這可能是由于干旱導(dǎo)致幼苗葉片細(xì)胞脫水, 增加脯氨酸的質(zhì)量比可降低細(xì)胞滲透勢, 有助于細(xì)胞吸水, 與文獻(xiàn)[17]對小麥的研究結(jié)果相同.凍融脅迫下, 幼苗的脯氨酸質(zhì)量比隨溫度變化先升高后降低.因此脯氨酸在植物經(jīng)歷低溫時(shí)可降低細(xì)胞冰點(diǎn), 防止細(xì)胞過度脫水[18-19].復(fù)合脅迫中D2+F組脯氨酸質(zhì)量比升高最明顯, 表明中度干旱加強(qiáng)了黑麥草幼苗的自適應(yīng)能力, 干旱及凍融脅迫出現(xiàn)聯(lián)合效應(yīng), 在經(jīng)歷低溫時(shí)可有效緩解凍傷, 與大葉冬青葉片的研究結(jié)果相似[20].

2.3 相關(guān)性分析

對干旱及凍融脅迫下黑麥草幼苗葉片的3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析, 結(jié)果表明：SOD活性與POD活性具有顯著正相關(guān)性, 相關(guān)系數(shù)為0.970(P<0.05); 脯氨酸的質(zhì)量比與SOD和POD活性變化間存在顯著相關(guān)性, 相關(guān)系數(shù)分別為0.899,0.939(P<0.05).

綜上所述, 本文研究了干旱及凍融對黑麥草的酶活性及脯氨酸質(zhì)量比的影響.結(jié)果表明: 單一脅迫和復(fù)合脅迫均導(dǎo)致黑麥草中SOD和POD活性升高及脯氨酸質(zhì)量比增加；復(fù)合脅迫大于單一脅迫對植物的影響；中度干旱+凍融脅迫對各指標(biāo)的影響最小.因此, 適當(dāng)進(jìn)行干旱處理可有效提高黑麥草對凍融脅迫的適應(yīng)能力, 降低凍融時(shí)低溫造成的傷害, 而嚴(yán)重的干旱脅迫會導(dǎo)致不可逆損傷.因此在東北地區(qū)種植牧草, 在牧草經(jīng)歷凍融前可對牧草進(jìn)行適度控水處理, 以提高其適應(yīng)低溫的能力, 從而減少低溫導(dǎo)致的減產(chǎn).