馮峰 湯鳳珍 姚明媚 程璐 杜利軍

世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]2019年報道，全球約有1/4的人口感染了結核分枝桿菌(MTB)，2018年新發(fā)患者約為1000萬例。中國是全球結核病高負擔國家之一。耐藥MTB的出現(xiàn)又增加了結核病防控和治療的難度?；蚪M學、轉錄組學和蛋白質(zhì)組學等新技術的出現(xiàn)，為結核病的病原、診斷、治療和耐藥性方面的研究提供了更加全面和完整的視角。筆者就蛋白質(zhì)組學在結核病防治領域的研究進展做一綜述。

一、蛋白質(zhì)組學技術介紹

1.基本概念：蛋白質(zhì)組這一概念最初由澳大利亞學者Wilkins和Willian在1994年首先提出。蛋白質(zhì)組指在一定生物范圍內(nèi)所表達的全部蛋白質(zhì)，如一個基因組、一個細胞、單個組織或個人和特定人群。蛋白質(zhì)組學是以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究其組成成分、表達水平和修飾方式，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用及對表型的影響，最終在整體水平把握蛋白質(zhì)組的生理特性和作用規(guī)律。

2.主要技術：蛋白質(zhì)組學技術包括基于色譜和質(zhì)譜的蛋白質(zhì)的分離、鑒定和定量，以及基于生物信息學的蛋白質(zhì)功能和修飾特征的研究。常見蛋白質(zhì)分離技術有二維凝膠電泳技術(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)[2]和基于色譜的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[3]技術。質(zhì)譜技術處于蛋白質(zhì)組學研究中的核心位置，其基本原理是通過改變環(huán)境電場和磁場，識別帶有不同質(zhì)量和電荷的粒子的運動軌跡，來判斷粒子的物理特性。根據(jù)蛋白質(zhì)粒子化方法的不同，分為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-MS, MALDI-TOF-MS)和電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionization-MS，ESI-MS)。根據(jù)質(zhì)量分析的方法不同，分為軌道離子阱質(zhì)譜和四極桿飛行時間質(zhì)譜(quadrupole time-of-flight，Q-TOF)技術，分辨率可小于2 ppm[4]。利用質(zhì)譜技術獲得的蛋白質(zhì)指紋圖譜，可結合各種生物學信息平臺或數(shù)據(jù)庫進行解析，可確定樣本中含有的蛋白質(zhì)種類及修飾特征。隨著技術改進，還出現(xiàn)了同位素標記相對和絕對定量結合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術[5]?，F(xiàn)今，部分醫(yī)院檢驗科微生物實驗室配備了適用于微生物種類鑒定的MALDI-TOF-MS，可直接快速檢測樣品中的微生物，具有高通量、敏感度好和特異度高的特點。

二、蛋白質(zhì)組學在MTB研究中的作用

1.MTB與巨噬細胞相互作用的蛋白質(zhì)組學研究：巨噬細胞是MTB在人體內(nèi)主要的寄生場所，也是其增殖和觸發(fā)機體免疫反應的主要環(huán)境[6]，從蛋白質(zhì)組學的角度了解MTB與人體巨噬細胞的相互作用有助于理解結核病的病理機制和MTB的免疫逃避作用。Menon等[7]使用定量蛋白質(zhì)組學技術識別感染了具有活性的MTB、加熱殺死的MTB和未感染MTB的人體巨噬細胞的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)感染活菌的巨噬細胞內(nèi)的胞質(zhì)脂滴的蛋白質(zhì)豐度增加，并伴隨有脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成和囊泡運輸功能的改變。利用生化方法和顯微鏡技術，證實了ADP核糖基化樣因子8B(ARL8B)在MTB感染的巨噬細胞的脂滴表面增加，且ARL8B是胞質(zhì)脂滴蛋白之一。這一研究為MTB在肺部形成干酪樣肉芽腫損傷提供了病理機制的理論依據(jù)。除了會影響所寄生的巨噬細胞的脂質(zhì)代謝，MTB還會影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達水平與修飾特征。Budzik等[8]通過研究MTB感染的巨噬細胞蛋白質(zhì)翻譯后修飾發(fā)生的變化，確定了數(shù)百個動態(tài)調(diào)控的磷酸化和泛素化位點，表明了在感染期間，細胞內(nèi)發(fā)生的預見和未預見的多種宿主通路的重構的顯著變化。這些變化大部分沒有從mRNA的角度反映出來，包括泛素介導的自噬激活。該分析還揭示了一種特殊的自噬受體蛋白TAX1BP1，介導了泛素化MTB的清除，且將細菌定位在LC3陽性的吞噬泡。這為了解巨噬細胞如何通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組的修飾應對感染提供了線索。

2.不同MTB菌株毒力的蛋白質(zhì)組學研究：MTB菌株H37Rv和H37Ra經(jīng)常用于MTB毒性和病理學機制的研究[9-11]。Verma等[12]使用高分辨傅里葉變換質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)了265個新的磷酸化位點。通過定量分析，發(fā)現(xiàn)H37Rv菌株的毒性相關Ⅶ型細菌分泌系統(tǒng)的蛋白表達量是H37Ra表達量的5倍以上，并且在其他84個蛋白表達量上也有差異。這些蛋白集中在脂肪酸生物合成和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)通路上。這為兩種菌株的毒性差異提供了理論依據(jù)。分枝桿菌屬中不同種的病原菌，甚至同種病原菌的不同菌株具有高度的基因組保守性，但不同菌種或菌株間的表型和相關的臨床特征迥異。為了考察一些菌種或菌株在蛋白質(zhì)水平的表型是否穩(wěn)定，以及蛋白質(zhì)水平的變化是否為造成不同臨床表現(xiàn)的原因，Peters等[13]使用液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)從蛋白質(zhì)定性和定量角度研究了7個不同的臨床相關的分枝桿菌菌株的蛋白質(zhì)組(含有4株分枝桿菌菌株、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG菌株和鳥分枝桿菌)，并用雙壓線性離子阱高分辨率組合型質(zhì)譜儀進行了分析。該研究鑒定出MTB特異的4023個理論蛋白中的3788個蛋白，并且在前6個菌株的每個菌株中平均鑒別出3290個特異的蛋白質(zhì)(占各菌株理論蛋白質(zhì)組的82%)，還鑒定出4250個鳥分枝桿菌的特異蛋白(占該菌種理論蛋白質(zhì)組的80%)。數(shù)據(jù)分析顯示，所有主要類別的蛋白在每一菌株中均有表達，但菌株間表達水平有明顯差異。再使用靶向選擇反應監(jiān)測(SRM)試驗定量觀察23個蛋白亞群的表達情況，這些蛋白是通過與基因表達數(shù)據(jù)對比確定的，與各菌株的毒力相關。該分析可能揭示了不同菌株間相對蛋白豐度對菌株毒性、耐藥性和傳播性的影響，為結核病病理、治療和防治研究提供了理論依據(jù)。

3.MTB中具有特定功能蛋白質(zhì)組的研究：盡管對MTB已有較多的蛋白質(zhì)組和轉錄組的研究，但對于轉錄組調(diào)控的方式和動力學研究仍然較少，所以有必要針對MTB轉錄組調(diào)節(jié)蛋白的組成和功能進行研究[14-15]。Pociński等[16]使用4-硫脲標記RNA的方法，繪制了微生物RNA結合蛋白質(zhì)組，并鑒別了降解體的相關酶，包含：多核苷酸磷酸化酶(PNPase)、ATP依賴性RNA解旋酶(RhlE)、核糖核酸酶E(RNase E)和核糖核酸酶J(RNase J)為主要成分。經(jīng)過對增強綠色熒光蛋白標記的重組構建物進行親和純化，以識別蛋白質(zhì)之間的相互作用，進一步證明了冷休克蛋白和新K同源(K-homology)結構域蛋白的相互作用。通過生物工程設計，降低菌株核糖核酸酶表達水平，為該酶在分枝桿菌RNA代謝中的多效作用提供了證據(jù)，提示其可作為潛在的藥物靶點。

激酶調(diào)節(jié)在MTB適應性反應中起著關鍵作用[17-18]。然而，對于MTB中參與每個磷酸化事件的特異性酶和功能特征的確認仍然滯后，其中，絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PknG)參與了多種MTB的代謝功能和致病性。因此，有必要識別菌中PknG的底物和作用位點。Gil等[19]使用了一種吸附純化質(zhì)譜策略，逐步揭示了PknG的底物和相互作用因子，以識別PknG的自發(fā)磷酸化位點。經(jīng)鑒定，獲得了7個假定底物和66個直接或間接的配體，說明PknG調(diào)節(jié)了氮和能量代謝，細胞壁合成和蛋白翻譯等多種生理代謝作用。其中，包括2個之前報道的PknG底物GarA和50S核糖體蛋白L13。使用比較蛋白質(zhì)組學分析了野生型和pknG缺失型MTB菌株，證明了2種激酶相互作用因子，包含F(xiàn)HA-結構域的蛋白GarA和谷氨酰胺合成酶確實是PknG的內(nèi)源性底物，進一步證明了PknG的氮代謝調(diào)節(jié)作用。以上結果證明了PknG在體外對谷氨酰胺合成酶和FhaA蛋白特定殘基的磷酸化作用，且這一過程也在菌內(nèi)發(fā)生，為理解MTB生理過程和藥物開發(fā)提供了理論依據(jù)。

4.蛋白質(zhì)組學對耐藥和休眠MTB的蛋白質(zhì)組研究：盡管臨床上已有多種用于治療MTB感染的藥物，結核病的治療仍然是一個臨床難題。治療效果不佳和耐藥菌的出現(xiàn)增加了結核病治療的難度。因此，有必要使用蛋白質(zhì)組學的方法理解結核病治療的特征。

MTB的耐藥性與細菌具有一定的生理特征聯(lián)系，蛋白質(zhì)組學的方法可以幫助我們理解這種生理特征，并為開發(fā)新的藥物奠定基礎。Sharma等[20]使用蛋白質(zhì)組學技術分析了MTB對阿米卡星和卡那霉素2種抗生素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)了20種過度表達的耐藥蛋白，并進行了鑒定。其中，有6種蛋白的功能未知或未被鑒定過，包含Rv3208A、Rv2623、Rv1360、Rv2140c、Rv1636和Rv2185c。對接結果表明，阿米卡星和卡那霉素可以結合于這些假設蛋白的保守結構域，且這些蛋白的過度表達會中和或調(diào)整藥物分子的效應。在使用TBPred預測服務器和原核類泛素化位點預測工具GPS-PUP 分別預測了這些已鑒別的蛋白質(zhì)的胞質(zhì)性質(zhì)和蛋白的原核類泛素蛋白化位點以后，蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫STRING分析表明蛋白過表達及其配體可能參與了氨基糖苷類藥物的耐藥。這些過表達蛋白的積累效應可能通過減輕毒性、抑制藥物靶點和中和作用而參與阿米卡星和卡那霉素的耐藥性。以上研究為MTB抗阿米卡星和卡那霉素的診斷和治療方法提供了一定的理論基礎。MTB也對對氨基水楊酸產(chǎn)生了耐藥性。Wei等[21]通過篩選和建立了對氨基水楊酸耐藥的folC變異和非變異株，利用多組學分析了MTB的對氨基水楊酸抗性，以分析其耐藥性的機制。發(fā)現(xiàn)通過S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶的促進和抑制一些藥物轉運相關膜蛋白對氨基水楊酸轉運的降低，是folC突變株耐藥的兩條主要途徑。而folC未突變株的耐藥性是通過外源性蛋氨酸的攝取緩解了抑制劑的作用，并且促進了DfrA、ThyA和FolC的表達。除了以上結果，該課題組還發(fā)現(xiàn)對氨基水楊酸耐藥可能與苯丙氨酸代謝途徑的增加有關。這些結果為folC變異株和非變異株的對氨基水楊酸耐藥性和隨后的治療方案的開發(fā)提供了線索。MTB的治療不止可以使用單一藥物，也可以進行聯(lián)合用藥，提高治療效果。de Keijzer等[22]使用蛋白質(zhì)組學的方法考察了用于治療精神病癥狀的藥物硫醚嗪治療MTB的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了MTB中與細胞膜通透性相關的蛋白表達的豐度的變化。進一步通過對病原菌內(nèi)熒光染色所經(jīng)過的時間積累的分析，確認了MTB長時間暴露于硫醚嗪可增加細菌細胞膜的通透性，從而開發(fā)抗結核藥品與硫醚嗪合用，以更有效地治療結核病的新方法。潘稚芬等[23]利用比較蛋白質(zhì)組學技術，將臨床獲得的耐多藥MTB菌體蛋白與標準株H37Rv進行比較，發(fā)現(xiàn)了重復性較好的耐多藥MTB菌株差異蛋白點11個，鑒定出其中8個蛋白，其中還原型輔酶Ⅰ(NADH)脫氫酶I B鏈(NuoB)在耐多藥MTB表達上調(diào)。通過對NuoB的分子生物學表達和隨后的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測不同人群血清中IgG對NuoB結合特征的觀察，發(fā)現(xiàn)耐多藥MTB感染者血清中的IgG陽性率為43.86%，在藥物敏感MTB感染者中為15.62%，在正常對照者中為10.00%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，為耐多藥MTB感染的診斷提供了理論基礎。

除了分析不同藥物的使用對結核病治療結果的影響，分析MTB在不同生理狀態(tài)下的表型特征，也可以為治療結核病，特別是潛伏性結核感染提供理論依據(jù)。Trutneva等[24]利用2-DE和MALDI-TOF-MS分析的方法，分析了存儲了1年以上處于休眠狀態(tài)停止分裂的MTB，這些細菌全部耐藥且發(fā)生了形態(tài)的改變。盡管有蛋白質(zhì)發(fā)生降解，休眠1年的MTB的蛋白質(zhì)組仍保有很大程度的完整性。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可能與大量參與蛋白質(zhì)保護的酶的存在有關，這些酶涉及氧化應激(katG/Rv1908，sodA/Rv3846，sodC/Rv0432，bpoC/Rv0554)，分子伴侶(dnaJ1/Rv0352，htpG/Rv2299，groEL2/Rv0440，dnaK/Rv0350，groES/Rv3418，groEL1/Rv3417，HtpG/Rv2299c，hspX/Rv2031)和DNA穩(wěn)定性蛋白。此外，休眠細胞蛋白質(zhì)組包含參與了特定代謝通路的酶，如糖酵解反應，縮短三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA循環(huán))和降解過程，從而能形成低水平代謝狀態(tài)，或者這些酶在休眠狀態(tài)下長期保存，以在重新活化的過程中發(fā)揮生物活性。這些對休眠狀態(tài)下MTB的觀察有利于理解其生理特征，為開發(fā)進一步的診斷和治療方法提供依據(jù)。Schubert等[25]使用了一種無標簽的，基于SWATH(sequential windowed acquisition of all theoretical fragmentions)質(zhì)譜的方法評估了絕對細胞蛋白濃度，考察了MTB指數(shù)生長期，缺氧誘導的休眠和復蘇過程中的蛋白質(zhì)重組。結果覆蓋了超過2000個蛋白質(zhì)，揭示了蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在這些過程中的分布特征。應激誘導的休眠存活調(diào)節(jié)子(dormancysurvival regulator，dosR)占有休眠期間20%的蛋白表達量，而核糖體蛋白的量維持在5%～7%不變。蛋白質(zhì)的絕對濃度還可以進一步將蛋白質(zhì)的轉變理解為最大酶促反應速率的轉變，從而進一步提高對代謝適應的理解。而對MTB的全面蛋白質(zhì)的測量可以提供一個定量描述病菌狀態(tài)的標準，從而為結核病治療的發(fā)展提供理論依據(jù)。

三、蛋白質(zhì)組學在結核病診斷和治療研究中的作用

MTB培養(yǎng)是結核病診斷的金標準，然而其一般耗時2～6周。痰涂片鏡檢快速，但敏感度較低。血清學診斷易被交叉感染影響。結核菌素皮膚試驗(TST)易被卡介苗的接種所影響，對免疫缺陷人群的敏感度較差[26]。而γ干擾素釋放試驗(IGRA)和結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)的假陰性或假陽性反應較多，且成本較高[27]。因此，仍需要篩選更加可靠的結核感染診斷標志物。

MTB感染的早期發(fā)現(xiàn)與否與患者臨床結局密切相關，因此，建立MTB感染早期診斷標準具有重要臨床價值。Bark等[28]觀察了104例HIV陰性MTB感染者的血清和血漿樣本，分為活動性結核病患者，潛伏性結核感染者，TST陽轉者和TST陰性者。在所有比較中，有289個蛋白的表達量差異有統(tǒng)計學意義(糾正錯誤發(fā)現(xiàn)率P<0.05)。與細胞免疫和脂質(zhì)代謝相關的蛋白質(zhì)在MTB早期感染中被誘導表達。使用質(zhì)譜對159種選定的蛋白進行試驗，對來自52個TST陽轉及保持陰性者的一系列縱向研究樣本進行分析，經(jīng)過多因素logistic回歸分析鑒定的特定蛋白質(zhì)組合可以預測TST檢測者的變化，其受試者工作特征曲線曲線下面積(AUC)值大于0.85。

通過血清中的蛋白標志物，區(qū)分活動性肺結核和肺結核患者密切接觸者，在結核病診斷和防治中具有重要的作用。Chen等[29]使用蛋白質(zhì)組微陣列方法研究了36例活動性結核病患者和18名健康對照者血清中的抗MTB的IgG和IgM抗體。結果顯示，多種抗原能誘導結核病患者血清中更高滴度的IgG或IgM應答，在這些抗體中，進一步通過ELISA從 221個樣品中驗證了Rv2026c和Rv2421c的存在，并通過多因素logistic回歸分析顯示其在結核病臨床分類中具有較好的表現(xiàn)。此外，通過受試者工作特征曲線(ROC)，得到組合的診斷條件的敏感度和特異度分別是82.5%和88.12%，優(yōu)于單一抗原的診斷。此外，Rv2026c和Rv2421c的抗體的反應性與患者的臨床背景有關(如性別和個體差異等)。這些結果表明，不同類型抗原和抗體的組合為血清學檢測結核病提供了進一步的理論支持。Mateos等[30]使用串聯(lián)質(zhì)譜10-plex同位素標簽的定量蛋白質(zhì)組學區(qū)分了活動性結核病患者，及其潛伏感染者和未感染的家庭接觸者，每組15個獨立血清樣本，重復5次試驗。使用液相色譜-離子肼質(zhì)譜儀進行肽段分析，和Proteome Discoverer 2.1處理原始數(shù)據(jù)后，共定量418個蛋白質(zhì)。結果顯示，活動性肺結核患者的蛋白質(zhì)特征與補體激活，炎癥和免疫調(diào)節(jié)有關，并通過減少一部分蛋白，包括載脂蛋白A和血清載鐵蛋白，表明了脂質(zhì)轉運和鐵同化在疾病過程中的作用。這些特征通過ELISA和濁度測定法進行后續(xù)的靶向測定隊列研究得到了進一步確定。該研究為區(qū)別潛伏感染者和活動性結核病患者提供了理論依據(jù)。

結核病治療期間，因為治療作用會使患者痰量減少，且痰培養(yǎng)對長期治療效果預測的準確性降低。因此，有必要探索反映結核病治療效果的診斷標準。Kedia等[31]使用敏感的離子淌度質(zhì)譜(IM-MS)描述感染初期和利福噴丁治療8周以后的血清蛋白質(zhì)組，試圖識別反映治療效果的特異信號，且將臨床治療效果與這些信號關聯(lián)起來。血清樣本來自參與疾病預防控制中心結核病研究項目的289例患者，樣品分別收集于每例患者的病程初期和強化治療結束期。使用免疫親和層析去除血清蛋白質(zhì)中的高豐度成分，再將樣本消化成肽段并使用液相IM-MS平臺(LC-IM-MS)采集分析數(shù)據(jù)。利用線性混合模型識別血清蛋白改變，以識別患者行抗結核治療的效果和痰培養(yǎng)結果的相關性。共鑒別和定量了872個蛋白質(zhì)的10 137個肽段，并進行了縱向的隊列分析。結果顯示，在結核病治療以后，有244個蛋白質(zhì)有明顯改變。通過通路/網(wǎng)絡比較，可知上調(diào)(脂質(zhì)轉運、凝血級聯(lián)、肽酶活性)和下調(diào)(急性期)的蛋白，和這些蛋白參與調(diào)控網(wǎng)絡(炎癥、細胞黏附、細胞外基質(zhì))的一系列通路。還發(fā)現(xiàn)反映肺損傷的血清蛋白質(zhì)乙酰肝素酶(HPSE)，在治療期間明顯下調(diào)。通過對微生物數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了一組對治療有所反映，且能與痰培養(yǎng)結果明顯關聯(lián)的核心血清蛋白[甲狀腺素運載蛋白(TTHY)、維生素E結合糖蛋白(AFAM)、C-反應蛋白(CRP)、視黃醇結合蛋白(RET4)、血清淀粉樣蛋白A(SAA1)、肽聚糖識別蛋白2(PGRP2)]。通過建立一個預測的蛋白質(zhì)基線，可以預測治療6～8周的痰培養(yǎng)狀態(tài)。以上研究為建立結核病臨床治療效果監(jiān)測提供了理論基礎。

四、應用前景

MTB的感染、發(fā)病和治療涉及到宿主和MTB內(nèi)多種生理反應和信號通路的作用。蛋白質(zhì)組學能從更宏觀更整體的角度上對這些現(xiàn)象進行觀察和分析。目前，MTB相關的蛋白質(zhì)組學研究集中在MTB生理特征的闡述及其造成的病理反應機制，結核病不同階段診斷標準的制定及MTB對治療藥品耐藥性的研究和新的治療方法的探索。在潛伏性結核感染的發(fā)現(xiàn)和耐藥結核病的治療方面，蛋白質(zhì)組學可以獲得一定范圍內(nèi)人群的瞬時MTB蛋白質(zhì)組學信息，但這些信息的變化特征依然不明確。在接下來的研究中，希望能建立基于蛋白質(zhì)組學的多地區(qū)，多人群的縱向動態(tài)MTB數(shù)據(jù)庫，以求減少空間、時間和人群特征的限制，更加動態(tài)立體地描述MTB的生理特征及病理特征。