孫 悅，張方方，褚遂興，李佳幸，邵 帥，張軍翔,

（1.寧夏大學葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021；2.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

葡萄酒的酒精發(fā)酵是多酵母屬、種及菌株共同參與的過程，發(fā)酵過程中的酵母菌的種類組成變化及其釀酒特性對葡萄酒的感官質量有重要貢獻[1-2]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是完成酒精發(fā)酵的主要菌種，葡萄酒發(fā)酵中的釀酒酵母菌株多性及其遺傳差異受年份、產區(qū)、氣候、葡萄品種和接種酵母的性能等因的影響[3-6]。即使在接種商業(yè)酵母的情況下，仍有野生釀酒酵母的不同株系共同參與發(fā)酵過程，野生釀酒酵母甚至可以表現出較強的競爭能力，并主導發(fā)酵過程[7-9]。因，對葡萄酒發(fā)酵過程中的主導釀酒酵母菌株進行監(jiān)控非常重要。接種嗜殺酵母進行葡萄酒釀造，在一定程度上可以凈化發(fā)酵體系、預防野生酵母菌污染，確保酒精發(fā)酵的正常進行，提高產品質量[10-14]。酵母菌的嗜殺特性與其培養(yǎng)時間、接種量、pH值和溫度等因有關[15-16]。

對接種發(fā)酵過程中釀酒酵母的菌株區(qū)分可以揭示野生酵母與接種的酵母的競爭關系和消長變化，有效控制發(fā)酵過程。本研究利用WLN營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和分子分析技術，研究了不同嗜殺特性的釀酒酵母菌株對赤霞珠葡萄酒精發(fā)酵過程中酵母菌群體及其數量影響，探索發(fā)酵過程中微生物之間的相互作用，為良好、健康的葡萄酒發(fā)酵提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

赤霞珠葡萄（糖221.57 g/L，總酸5.9 g/L，pH 3.54） 寧夏銀川產區(qū)；釀酒酵母：NXU17-26（中性菌株） 寧夏大學葡萄酒學院葡萄酒微生物資源與遺傳育種實驗室；UCD2610（嗜殺菌株）、UCD522（敏感菌株） 美國加州大學戴維斯分校葡萄栽培與葡萄酒釀造系菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，添加100 mg/L的氯霉排除細菌的干擾。配制固體培養(yǎng)基時加入2%的瓊脂。

WLN營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制見參考文獻[21]。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；SHP-150B型生化培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司；GDH-100干式恒溫器 上海巴玖實業(yè)有限 公司；5424R臺式冷凍離心機 德國艾本德股份公司；TAdvanced 96 SG基因擴增儀 德國耶拿分析儀器股份公司；ChampGel 15000全自動凝膠成像儀 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄汁發(fā)酵

本實驗設置了4 種發(fā)酵處理方式：A.自然發(fā)酵；B.接種中性菌株NXU17-26的發(fā)酵；C.接種敏感菌株UCD522的發(fā)酵；D.接種嗜殺菌株UCD2610的發(fā)酵。用無菌自封袋將成熟的葡萄原料在無菌狀態(tài)下進行除梗破碎，于滅菌的1 L三瓶中進行帶皮發(fā)酵，發(fā)酵體積為700 mL，每個處理設置兩個發(fā)酵重復。對于接種發(fā)酵而言，在葡萄破碎后的第2天進行接種，接種 量為106CFU/mL。所有的發(fā)酵均于25～28 ℃控溫發(fā)酵，采用CO2失重法監(jiān)控發(fā)酵進程，發(fā)酵至連續(xù)損失質量2 d變化低于0.1 g時視為發(fā)酵結束。待發(fā)酵結束后分析原酒的基本理化指標。

1.3.2 酵母菌的分離

1.3.3 理化指標分析

發(fā)酵結束后的殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸質量濃度和乙醇體積分數等指標參照GB/T 15038ü 2006《葡萄酒、果酒通用分析法》[22]。

1.3.4 菌株的WLN培養(yǎng)基聚類分析

將保藏的酵母菌劃線接種于WLN培養(yǎng)基上，酵母菌株的初步形態(tài)分類參考文獻[21,23]。

1.3.5 酵母菌DNA的提取

DNA的提取方法參考文獻[24]。

1.3.6 酵母菌26S rDNA D1/D2測序分析

26S rDNA D1/D2區(qū)的擴增的PCR反應體系及條件參照文獻[25]。

Interdelta分型法進行釀酒酵母分析的PCR體系、電泳條件及數據處理參照文獻[6]。

1.3.8 聚類分析

1.4 數據處理

所得數據通過Office 2007和SPSS Statistics V19.0進行均值和方差分析，采用Duncan檢驗方法（P＜0.05）；繪圖軟件使用Origin 8.0。

2 結果與分析

2.1 不同釀酒酵母菌株的發(fā)酵曲線

本研究采取CO2失重法監(jiān)控不同發(fā)酵的發(fā)酵進程，接種不同酵母菌株的發(fā)酵曲線（CO2累計釋放量表示）如圖1所示。從發(fā)酵曲線可以看出，接種發(fā)酵（10 d）比自然發(fā)酵（15 d）快5 d發(fā)酵結束。接種發(fā)酵在啟酵和發(fā)酵速度上均快于自然發(fā)酵，敏感菌株UCD522和嗜殺菌株UCD2610的發(fā)酵速度最快，中性菌株NXU17-26次之，而自然發(fā)酵的發(fā)酵速度最慢（圖1）。

圖 1 接種不同釀酒酵母菌株發(fā)酵的CO2失重曲線Fig. 1 Comparison of CO2 mass loss among fermentations inoculated with different S. cerevisiae strains

對于自然發(fā)酵而言，葡萄醪中的酵母菌主要來源于葡萄果皮，而這些酵母主要為非釀酒酵母，非釀酒酵母的發(fā)酵能力較釀酒酵母的弱，且對酒精的耐受性更低，因，發(fā)酵的時間比接種釀酒酵母的發(fā)酵時間長。

2.2 發(fā)酵結束后的理化指標

表 1 赤霞珠發(fā)酵結束后的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of fermented Cabernet Sauvignon

如表1所示，各發(fā)酵處理均能發(fā)酵完全（殘?zhí)牵? g/L）， 且各理化指標均差異不顯著。由于本研究選用的是同一批次的葡萄原料進行的發(fā)酵研究，各發(fā)酵中的起始糖濃度、酸濃度和pH值等理化指標無顯著差異，所有發(fā)酵均順利完成（圖1）。因，并未造成發(fā)酵后的葡萄酒中殘?zhí)?、總酸質量濃度和乙醇體積分數等理化指標存在顯著差異。

2.3 不同發(fā)酵中酵母菌種類的差異

2.3.1 WLN初步聚類分析

表 2 WLN聚類結果分析Table 2 Analysis of WLN clustering results

WLN營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)將赤霞珠葡萄發(fā)酵過程分離到的480 株酵母菌的顏色和形態(tài)進行聚類分析，參照Pallmann等[21]對WLN瓊脂培養(yǎng)基上酵母菌落顏色以及形態(tài)的描述，將分離到的480 株酵母菌分為7 個不同的培養(yǎng)類型。結果表明，類型2的數量最多，占分離自總菌株的62.71%，其次是類型4和類型5，分別為69 株和70 株。

圖 2 代表性菌株在WLN上的聚落特征Fig. 2 Cluster characteristics of representative strains on WLN

2.3.2 26S rDNA D1/D2區(qū)測序分析

表 3 測序菌株26S rDNA D1/D2片斷大小及與相關菌株的序列相似性Table 3 Size of the 26S rDNA D1/D2 fragment and sequence similarity to related strains

如表3所示，表明赤霞珠發(fā)酵過程中的酵母菌有4 屬5 種，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和庫徳畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。不同發(fā)酵處理的酵母菌種類也不同，接種釀酒酵母的發(fā)酵中酵母多性低于自然發(fā)酵，各接種發(fā)酵處理之間酵母多性無差異。結果表明，自然發(fā)酵過程中共分離出酵母菌4 屬5 種；接種發(fā)酵中分離出酵母菌均為2 屬2 種：H. uvarum和S. cerevisiae。

表 4 發(fā)酵過程中酵母菌的細胞總數Table 4 Total yeast counts in different fermentations

如表4 所示，在發(fā)酵的各時期，自然發(fā)酵中的酵母菌數量相對較高。接種嗜殺酵母U C D 2 6 1 0的發(fā)酵，在發(fā)酵的第5 天酵母菌的數量達到最大值 （28.4f 6.58）×106CFU/mL；其余發(fā)酵中酵母菌的數量，均在發(fā)酵第3天達到最大值。如圖3所示，不同發(fā)酵處理的酵母菌種屬組成也存在明顯的差異，自然發(fā)酵中非酵母屬的比例較其他發(fā)酵的高。隨著發(fā)酵的進行，各發(fā)酵中非酵母屬酵母的比例下降，釀酒酵母逐漸占主導地位并完成酒精發(fā)酵；在發(fā)酵中后期，接種嗜殺酵母UCD2610的發(fā)酵中，非酵母屬酵母的數量較其他發(fā)酵的低。

圖 3 不同處理中釀酒酵母與非酵母屬的比例Fig. 3 Proportions of S. cerevisiae and non-Saccharomyces under different treatments

2.4 發(fā)酵過程中釀酒酵母菌株多性分析

本研究對不同接種條件下各發(fā)酵時期的釀酒酵母（類型G4、類型G5和類型G7，共165 株）進行了Interdelta指紋圖即不同基因型的分析，將分離到的165 株釀酒酵母鑒定為11 種基因型（如圖4所示G1～G11）。自然發(fā)酵中分離的18 株釀酒酵母表現出相同基因型（G1） （圖4A）；接種中性菌株NXU17-26的發(fā)酵中分離出52 株釀酒酵母，表現出3 種基因型（G2～G5），其中G2（33 株）與NXU17-26具相同基因型（圖4B），是發(fā)酵中的優(yōu)勢酵母，NXU17-26的基因型占比為63.46%；接種敏感菌株UCD522的發(fā)酵中共分離出47 株釀酒酵母，表現出3 種基因型（G6-G8），其中類型G8與接種的UCD522具相同基因型（圖4C），菌株數為21（基因型占比為44.68%），其中G6類型的酵母16 株（基因型占比為34.04%）；接種嗜殺菌株UCD2610的發(fā)酵中共分離出51 株釀酒酵母，表現出4 種基因型（G9～G11），其中類型G9與所接種的UCD2610具相同基因型（圖4D），菌株數為32（基因型占比為62.74%）。接種發(fā)酵中，接種的釀酒酵母在發(fā)酵中占主導地位，接種的敏感釀酒酵母占總釀酒酵母的比例較接種的其他兩個酵母的低，這可能是因為發(fā)酵過程中野生釀酒酵母NXU18-15（G6）具較強的競爭力，影響了敏感酵母UCD522的生長。

圖 4 本研究中分離的釀酒酵母Interdelta指紋圖譜Fig. 4 Interdelta fingerprinting patterns of S. cerevisiae strains

2.5 UPGMA聚類分析

圖 5 11 株釀酒酵母Interdelta指紋圖譜UPGMA聚類圖Fig. 5 UPGMA dendrogram generated from Interdelta fingerprinting patterns of 11 S. cerevisiae strains

通過對分離到的上述8 種野生釀酒酵母基因型及NXU17-26、UCD522和UCD2610的Inerdelta結果進行UPGMA聚類分析，以說明各菌株間的遺傳關系。從圖5可以看出，當歐式距離為0.50時，可將11 株釀酒酵母基因型分為5大類：第I類包括1 種基因型，為分離自自然發(fā)酵的基因型NXU18-01；第II和第V類，分別由分離自接種敏感菌株UCD522和嗜殺菌株UCD2610的發(fā)酵中的基因型組成；第III和第IV類，由分離自接種中性菌株 NXU17-26的發(fā)酵中的基因型組成。以上聚類結果顯示，除個別菌株外（NXU28-28），分離自相同發(fā)酵中的釀酒酵母菌株間遺傳差異性較小，而分離自不發(fā)酵中的釀酒酵母菌株間遺傳差異性較大。

3 討 論

本研究中分離到的酵母菌屬于4 屬5 種：葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤酵母、H. burtonii、釀酒酵母和庫徳畢赤酵母。宋育陽等[26-27]在寧夏地區(qū)蛇龍珠和神索葡萄自然發(fā)酵過程也分離得到葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤酵母和釀酒酵母。研究表明，葡萄汁有孢漢遜酵母是葡萄及葡萄酒發(fā)酵過程中常見的非酵母屬酵母，且對葡萄酒風味形成具重要作用[28-29]。本研究中，葡萄汁有孢漢遜酵母是最豐富的非酵母屬酵母，其在發(fā)酵過程中可能有助于葡萄酒風味的形成，因對其發(fā)酵特性及在葡萄酒釀造中的價值有待進一步研究。

對葡萄酒發(fā)酵過程中的主導釀酒酵母菌株研究，不僅能揭示發(fā)酵過程中菌落的構成，還能監(jiān)控發(fā)酵的過程，酵母菌株的釀造特性不同，特別是嗜殺特性，使各發(fā)酵中酵母菌株之間的相互作用有所不同。即使在接種商業(yè)酵母的情況下，野生釀酒酵母也可以表現出較強的競爭能力，在發(fā)酵過程中處于優(yōu)勢地位。宋育陽等[7]研究接種商業(yè)酵母RC212的黑比諾葡萄發(fā)酵過程中釀酒酵母菌株動態(tài)變化發(fā)現，在發(fā)酵初期和中期，RC212與野生釀酒酵母的競爭性并不是很強，到了發(fā)酵末期才開始占據主導地位。Vigentini等[8]研究表明，在酒廠A的接種發(fā)酵中，共鑒定出18 種基因型，所接種的釀酒酵母菌株占的比例為44%～100%。Maturano等[30]研究了接種中性釀酒酵母菌株Lalvin ICV D254和嗜殺酵母Lalvin Rh?ne 2056進行發(fā)酵，不同溫度下浸漬處理的釀酒酵母菌株定殖情況，結果表明接種嗜殺酵母Rh?ne 2056的發(fā)酵中該菌株并沒有在所有的發(fā)酵中占主導地位。本研究中，接種的釀酒酵母在發(fā)酵中均占主導地位，因研究接種不同釀酒酵母發(fā)酵過程中酵母菌株及其演替規(guī)律很有必要。接種敏感菌株UCD522的發(fā)酵中，野生釀酒酵母NXU18-15表現出較強競爭力，通過對其釀酒特性的研究有望獲得適于發(fā)酵的本土優(yōu)良酵母菌株。外，接種不同釀酒酵母菌株發(fā)酵過程的釀酒酵母菌株多性差異明顯，結果與李梅花[9]的研究結果類似。

我國大多數葡萄酒生產企業(yè)使用商業(yè)釀酒酵母即活性干酵母釀造葡萄酒，商業(yè)釀酒酵母對我國本土酵母菌資源的影響及其者間的互作關系鮮見相關報道。 Sun Yue等[6]對寧夏葡萄酒產區(qū)分離的47 株釀酒酵母菌株進行Interdelta分型研究，結果表明自然發(fā)酵中分離的酵母菌和商業(yè)酵母菌株具有相同的基因型。楊寬等[28]利用UPGMA法構建云南香格里拉葡萄酒產區(qū)所分離的47 株釀酒酵母及3 株商業(yè)酵母菌株的聚類圖，結果表明一些葡萄園中分離的釀酒酵母菌和商業(yè)菌株具有相同的基因型。本研究中，自然發(fā)酵未分離出與接種酵母相同的基因型。因，亟需對我國本土酵母菌資源進行收集與開發(fā)。對自然發(fā)酵中分離的我國本土釀酵母菌資源進行分離、鑒定，可為后續(xù)優(yōu)良本土酵母菌株的篩選奠定基礎，保護我國本土酵母菌資源多性。

4 結 論

本研究對接種不同嗜殺特性的釀酒酵母NXU17-26、UCD522和UCD2610的赤霞珠葡萄發(fā)酵中的酵母菌進行了分離鑒定和多性研究。通過結合WLN和26S rDNA基因序列分析將其鑒定為4 屬5 種。其中，自然發(fā)酵中葡萄汁有孢漢遜酵母為優(yōu)勢種，接種發(fā)酵中釀酒酵母為優(yōu)勢種。同時利用Interdelta指紋圖法和UPGMA聚類對釀酒酵母的菌株多性進行了分析，結果顯示，所接種的釀酒酵母是相應發(fā)酵中的優(yōu)勢菌，在接種敏感菌株UCD522的發(fā)酵中，野生釀酒酵母NXU18-15表現出較強的競爭力（基因型占比為34.04%），基因型占比僅次于UCD522（44.68%）。外，分離自相同發(fā)酵中的釀酒酵母菌株間遺傳差異性較小，分離自不同發(fā)酵中的釀酒酵母菌株間遺傳差異性較大。