劉威良，毛瑞霞，王雪,2,，姬 昱，趙存朝，魏光強，黃艾祥

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201）

飲酒過量或飲酒不當會造成乙醇在體內(nèi)代謝產(chǎn)生許多有害物質(zhì)及大量自由基，給人體造成很大傷害，長期飲酒不僅會造成大腦功能障礙和意識障礙，還會形成慢性乙醇中毒[1-3]。飲酒帶來最大傷害的是肝臟，因為乙醇進入人體后90%以上是由肝臟代謝，而肝臟所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物及酒造成肝細胞代謝紊亂，是引起乙醇性肝損傷的主要原因[4-6]。我國古代著名醫(yī)藥學家李時珍所著的《本草綱目》中記載有：“凡酒醉不醒之人，用生葛根搗汁飲，方可解‘酒毒’”，可見葛根中含有一些解酒功效成分，具有一定的開發(fā)利用價值[7]。現(xiàn)代市售的解酒、醒酒產(chǎn)品發(fā)揮其功效多是基于該類產(chǎn)品在人體服用后能夠影響乙醇代謝或抑制乙醇吸收[8-9]，但不能直接降解體內(nèi)乙醇。很多醒酒藥并沒有實質(zhì)的醒酒作用，只是起到安慰鎮(zhèn)定、緩解頭痛等作用，有些醒酒藥雖具有一定解酒、醒酒功效，但也會伴隨著不同的副作用，對人體健康不利。

微生物生長過程需要碳水化合物，若其可以利用乙醇作為碳源之一，就能起到降解乙醇的作用，但對于這方面的研究報道較少。因，本實驗以前期確定的10 株發(fā)酵性能良好、食用安全的乳酸菌為出發(fā)菌種，通過乙醇耐受度、乙醇降解能力測定，篩選出具有較強乙醇降解能力的菌種，并以菌種與瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球菌互配，用牛奶、新鮮葛根、蔗糖為原料生產(chǎn)一種解酒發(fā)酵乳產(chǎn)品；進一步在體外模擬、腸液消化條件下分析該發(fā)酵乳產(chǎn)品對乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性及抗氧化活性的影響，結(jié)合體內(nèi)動物灌實驗構(gòu)建大鼠急性乙醇致肝損傷模型[10]，檢測大鼠血液中乙醇含量及其對血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性的影響，分析該發(fā)酵乳產(chǎn)品對肝細胞的保護作用，為后續(xù)解酒功能性產(chǎn)品的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物： S D 雄性大鼠4 0 只（ 體質(zhì)量180～250 g），動物許可證號 SCXK（滇）2016-0002，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

L-谷光甘肽 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；1,1-聯(lián)苯基-2-苦基肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海源葉生物科技有限公司；海王金樽片 海王健康科技發(fā)展有限公司；ADH 美國Sigma公司；MRS改良培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；ALT測定試劑盒、AST測定試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

URA14M0018型分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；TGL20M型高速冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司；SVJ-358型智能商用型酸奶機 北京世紀陽 光科技發(fā)展有限公司；SW-CJ-IF型單人雙面超凈無菌操作臺 蘇州江東精密儀器有限公司；HPX-9272ME型恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；ZQLY-180S型振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；TRACE 1300型氣相色儀、Tri Plus 300型頂空進器、Multiskan Go型酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Thermo公司；GMSX-280型壓力蒸汽滅菌器 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

分別取適量乳酸菌菌株凍干粉接種于10 mL滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，旋渦混勻，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，得到1 代菌懸液。按10%的接種量將1 代菌懸液再接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，得到2 代菌懸液。重復(fù)上述步驟，37 ℃恒濕培養(yǎng)12 h，得到3 代菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌種馴化

將活化好的乳酸菌菌懸液接種到牛乳中進行馴化增殖，依次調(diào)整菌種接種量為8%、6%、4%、2%，40 ℃恒溫培養(yǎng)至凝乳，需保證菌種活力能在4 h內(nèi)凝乳。

1.3.3 乙醇耐受菌種的篩選

將稀釋到適宜稀釋度的10 株乳酸菌分別取0.1 mL接種于添加量為0%、10%、15%、20%無水乙醇的滅菌MRS改良培養(yǎng)基中[11-12]，每組3 個平行，用搖珠進行涂布，于37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。參照GB 4789.35ü 2010《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行乳酸菌總數(shù)測定，以活菌數(shù)為指標，篩選得到乙醇耐受菌種。

1.3.4 乙醇降解菌種的篩選

1.3.4.1 溶液配制

乙醇標準液：精密吸取無水乙醇適量，加入蒸餾水中，配成體積分數(shù)1%、2%、3%、4%、5%的乙醇標準液；重鉻酸鉀-硫酸溶液：取重鉻酸鉀1 g溶于25 mL水中，邊攪拌邊緩慢加入4 mL濃硫酸；乙醇富集培養(yǎng)液：取3%乙醇耐受菌液加入50 mL滅菌MRS改良培養(yǎng)基的三瓶中，于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h，使培養(yǎng)基中乙醇耐受菌充分富集，同時以MRS培養(yǎng)液為溶劑，分別配制20%、40%乙醇體積分數(shù)的MRS乙醇培養(yǎng)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4.2 乙醇標準曲線繪制

向試管中分別加入0%、10%、20%、30%、40%、50%的乙醇標準液0.1 mL，每個試管中加入重鉻酸鉀-硫酸溶液1.0 mL，充分搖勻，蓋好蓋子；將試管置于沸水浴中10 min，使重鉻酸鉀-硫酸溶液充分氧化；取出試管，于610 nm波長處測定重鉻酸鉀-硫酸溶液的吸光度。以乙醇體積分數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作乙醇標準曲線（y=0.162x0.002 3，R2=0.997 4），根據(jù)標準曲線計乙醇體積分數(shù)。

1.3.4.3 乙醇降解能力測定

參照高慧[13]的方法，分別取不同體積分數(shù)乙醇培養(yǎng)液5 mL于試管內(nèi)，將篩選到的菌株200 μL接種于培養(yǎng)液內(nèi)，混勻靜置，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。以不加菌液的MRS乙醇培養(yǎng)液作為對照，利用重鉻酸鉀-硫酸法測定乙醇殘留量，分析各菌種的乙醇降解能力。

1.3.5 解酒發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝流程

選用生產(chǎn)酸奶及發(fā)酵乳常用的基礎(chǔ)菌種嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌與最佳的乙醇降解菌種嗜酸乳桿菌復(fù)配為發(fā)酵菌種，分別發(fā)酵牛乳和葛根液，再進行調(diào)配得到解酒發(fā)酵乳，具體流程如下：

1.3.6 解酒發(fā)酵乳體外功能活性分析

人工模擬腸液的配制：稱取KH2PO46.85 g，加蒸餾水500 mL使其溶解，用0.4 g/100 mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋，然后加入1 g/100 mL的胰蛋白酶，加水使其充分溶解，定容至1 L，混勻備用。

1.3.6.2 解酒發(fā)酵乳對ADH活性的影響

1.3.6.3 解酒發(fā)酵乳的體外抗氧化活性

1.3.7 解酒發(fā)酵乳體內(nèi)功能活性分析

1.3.7.1 解酒發(fā)酵乳對醉酒大鼠體內(nèi)乙醇含量的影響

雄性大鼠40 只，隨機分為4 組，每組8 只，分為對照組、海王金樽組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，確保各組老鼠體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05）。各組大鼠禁食16 h后，用16 mL/kg劑量的白酒進行灌。以翻正反射消失為醉酒指標，達到醉酒狀態(tài)后進行解酒發(fā)酵乳灌，低、中、高劑量組的解酒發(fā)酵乳灌量分別為1.5、3、6 mL/kg，對照組以灌生理鹽水為空白對照、灌解酒藥物海王金樽為陽性對照。灌后，灌酒1 h采用大鼠眼內(nèi)眥取血（用定量毛細管吸取一定體積血液），灌入解酒發(fā)酵乳后1、2、3 h分別取全血，采用頂空氣相色法[16-17]測定乙醇含量，分析解酒發(fā)酵乳對醉酒大鼠體內(nèi)乙醇的降解能力。

1.3.7.2 解酒發(fā)酵乳對醉酒大鼠肝損傷的保護作用

1.3.8 測定方法

1.3.8.1 ADH激活率測定

采用瓦勒-霍赫法[20-21]測定ADH活性。吸取焦磷酸鈉緩沖液1.5 mL、NAD1.0 mL、乙醇溶液0.5 mL和品0.1 mL相混合，25 ℃加蓋溫浴5 min后，立即加入ADH溶液0.1 mL并搖勻，用分光光度計測定340 nm波長處的吸光度，以后每隔10 s讀數(shù)一次，連續(xù)測定5 min。以不加品的反應(yīng)組為空白對照，以吸光度對時間作曲線圖，取反應(yīng)液最初組分，計在340 nm波長處吸光度每10 s的增加值，再根據(jù)NADH在340 nm波長處的摩爾消光系數(shù)為6.2，計酶活性。ADH活性以每分鐘NADH生成物質(zhì)的量（nmol）表示，ADH激活率計如式（1）所示：

1.3.8.2 DPPH自由基清除能力測定

參照曾麗等[22]方法，分別吸取處理方式不同的解酒發(fā)酵乳的等量上清液，加入31 μg/mL DPPH溶液，充分振搖后，室溫下暗處放置0.5 h，于517 nm波長處測定吸光度。以谷光甘肽為標準品，繪制標準曲線回歸方程為y=0.017 1x0.318 6（6.4～38.4 μg/mL，R2= 0.992 5）；y為DPPH自由基清除率，x為谷光甘肽質(zhì)量濃度（μg/mL）。DPPH自由基清除率計如式（2）所示：

式中：A1為實驗組吸光度；A2為品干擾實驗吸光度（調(diào)零）；A3為DPPH-甲醇溶液吸光度；A4為蒸餾水吸光度（調(diào)零）。

1.3.8.3 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參照黃佳琦[23]、Agrawal[24]等方法并進行修改。分別吸取處理方式不同的解酒發(fā)酵乳的等量上清液，加入ABTS稀釋工作液3.8 mL，室溫下反應(yīng)6 min，于734 nm波長處測定吸光度。以谷光甘肽為標準品，繪制標準曲線回歸方程為y=0.010 9x0.057 6（9.6～57.6 μg/mL，R2=0.992 6）；y為ABTS陽離子自由基清除率，x為谷光甘肽質(zhì)量濃度（μg/mL）。ABTS陽離子自由基清除率計如式（3）所示：

式中：A1為實驗組吸光度；A2為品干擾實驗吸光度（調(diào)零）；A3為ABTS工作液吸光度；A4為蒸餾水吸光度（調(diào)零）。

1.3.8.4 大鼠全血中乙醇含量測定

標準曲線制作：分別取0、0.1、0.2、0.4、0.8 mL的乙醇標準儲備液（200 mg/100 mL）于10 mL頂空瓶中，加入空白組血液至1 mL，配制成質(zhì)量濃度為0、20、40、80、160 mg/100 mL，混勻后置于頂空裝置中70 ℃恒溫30 min，自動進上層氣體1 mL，以保留時間定性，以面積定量，以乙醇質(zhì)量濃度（mg/100 mL）為橫坐標，面積（mV）為縱坐標繪制標準曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果以f s表示，統(tǒng)計學差異分析方法采用ANOVA的Tukey方法， P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇降解菌種的篩選

2.1.1 乙醇耐受菌篩選

表 1 10 株乳酸菌在不同乙醇體積分數(shù)下培養(yǎng)12 h的活菌數(shù)變化Table 1 Changes in viable cell count of 10 Lactobacillus strains cultured at different ethanol concentrations for 12 h

實驗前期通過發(fā)酵性能測定選取嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌等10 株發(fā)酵性能良好且食用安全的菌株，在15%、20%乙醇體積分數(shù)下測定其對乙醇的耐受度。由表1可知，副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌3 株菌相比其他7 株乳酸菌，在2 種乙醇體積分數(shù)下的活菌數(shù)較多，其中以嗜酸乳桿菌的存活數(shù)最多，可能是3 株菌自身帶有相關(guān)乙醇耐受基因[25-26]，在含有乙醇的環(huán)境下依然能夠較好的生長，具有較好的乙醇耐受能力。

2.1.2 乙醇降解菌篩選

通過乙醇耐受度測定得到1 株乙醇耐受效果最明顯的菌種嗜酸乳桿菌。由圖1可知，在20%乙醇體積分數(shù)下，嗜酸乳桿菌乙醇降解效果最好，培養(yǎng)24 h后乙醇為10%左右，副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌次之，其他菌株變化不明顯；在40%乙醇體積分數(shù)下，嗜酸乳桿菌的乙醇降解效果也是最好，培養(yǎng)24 h后乙醇降為15%左右，副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌次之，降解效果均沒有嗜酸乳桿菌明顯。由表明，在20%、40%乙醇體積分數(shù)下，嗜酸乳桿菌能夠有效利用乙醇作為碳源之一，從而發(fā)揮降解乙醇的作用[27]。因，最終選取嗜酸乳桿菌作為最佳的乙醇降解菌種。

圖 1 20%（A）和40%（B）乙醇體積分數(shù)下菌種的降解效果Fig. 1 Ethanol degradation ability of 10 strains at 20% (A) and 40% (B) ethanol concentration

2.2 解酒發(fā)酵乳的體內(nèi)外功效評價

表 2 模擬胃、腸液消化條件下ADH激活率測定Table 2 ADH activation rates of fermented milks in simulated gastrointestinal tract

表 3 模擬胃、腸液消化條件下自由基清除能力 Table 3 Free radical scavenging capacities of fermented milks in simulated gastrointestinal tract μmol/mL

2.2.3 解酒發(fā)酵乳對醉酒大鼠體內(nèi)乙醇含量的影響

圖 2 灌入解酒發(fā)酵乳前后大鼠血液中乙醇含量變化Fig. 2 Change in blood alcohol concentration of alcohol-drinking rats at different times after oral administration of fermented milk

2.2.4 解酒發(fā)酵乳對醉酒大鼠肝損傷的保護作用

血清酶學中對ALT和AST的檢查是診斷肝損傷的重要指標，肝細胞發(fā)生實質(zhì)性損害時，細胞膜通透性改變，胞內(nèi)的ALT和AST釋放至血液中，導(dǎo)致血中酶活性 偏高[32]。正常肝臟組織中轉(zhuǎn)氨酶含量是血液的100 倍，當肝臟出現(xiàn)實質(zhì)性損傷時，若出現(xiàn)1%的肝細胞壞死狀況，血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性即提高數(shù)倍，所以AST和ALT活性是考察肝損傷的敏感性指標[33]。

圖 3 灌入解酒發(fā)酵乳前后大鼠血清中AST（A）、ALT（B）活性變化Fig. 3 Changes in serum AST (A) and ALT (B) activity in rats at different times after oral administration of fermented milk

如圖3所示，與空白對照組相比，大鼠灌酒1 h后分別灌入低、中、高劑量的解酒發(fā)酵乳，在3 個時間段大鼠血清中AST和ALT活性均顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性，陽性對照組后3 個時間段血清中AST和ALT活性均高度顯著（P＜0.001）。其中，中、高劑量組分別在2、3 h后大鼠血清中AST和ALT活性出現(xiàn)明顯下降（P＜0.001），尤其在3 h遠低于空白對照組、略高于陽性對照組，可能是因為解酒發(fā)酵乳中的乙醇降解菌和葛根發(fā)生了協(xié)同作用，有效緩解大鼠肝細胞發(fā)生實質(zhì)性損害，從而抑制了胞內(nèi)ALT和AST的釋放[34]。由表明，解酒發(fā)酵乳對乙醇致肝損傷有較好的保護作用，降低動物血清中AST和ALT活性，可有效預(yù)防肝細胞因乙醇過度刺激導(dǎo)致的壞死。

3 結(jié) 論

過量飲酒會使乙醇在人體內(nèi)代謝產(chǎn)生有害物質(zhì)及大量自由基，為緩解過量飲酒對人體造成的傷害，本實驗以前期確定的10 株發(fā)酵性能良好、食用安全的乳酸菌為出發(fā)菌種，通過乙醇耐受度、乙醇降解能力測定，篩選出具有高效乙醇降解能力的嗜酸乳桿菌，并以菌種與瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球菌互配，用牛奶、新鮮葛根、蔗糖為原料生產(chǎn)出一種解酒發(fā)酵乳產(chǎn)品。該發(fā)酵乳產(chǎn)品在體外模擬、腸液消化條件下，能使ADH激活率分別達到（36.87f 1.58）%、（33.64f 1.90）%，ABTS陽離子自由基清除能力分別為（1 293.72f 4.12）、（729.98f 21.37）μmol/mL，DPPH自由基清除能力分別為（16.14f 0.12）、（11.26f 0.10）μmol/mL；大鼠體內(nèi)灌不同劑量的解酒發(fā)酵乳均能降低血液中乙醇含量，尤其是高劑量組3 h后降為51.62 mg/100 mL（P＜0.001），并能不同程度地降低大鼠血清中ALT和AST活性且呈劑量依賴性，對乙醇所致肝損傷有較好的保護作用。該研究可為后續(xù)解酒功能性產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的科學依據(jù)。