王麗佳

作者單位：無錫市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫 214002

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種內(nèi)分泌疾病，在生育期女性中較為常見。PCOS 病人卵泡液內(nèi)有氧化應(yīng)激狀態(tài)的異常，PCOS 的發(fā)病與活性氧的代謝失衡有關(guān)，抗氧化劑能改善PCOS的預(yù)后［1-4］。褪黑素是松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其抗氧化活性很強(qiáng)［5-6］。近年的研究發(fā)現(xiàn)褪黑素具有抗氧化活性，能有效地清除自由基、調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，具有極強(qiáng)的給電子活性和下調(diào)氧化應(yīng)激水平的作用［7-9］。本研究通過測(cè)定PCOS 病人卵泡液中總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）以及褪黑素、丙二醛（malondialdehyde，MDA）表達(dá)，旨在探討PCOS 病人卵母細(xì)胞質(zhì)量降低的因素與機(jī)制，為改善輔助生殖技術(shù)治療提供科學(xué)根據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)選取2016年1 月至2017年12 月無錫市婦幼保健院收治的不孕病人50 例，其中觀察組30 例為PCOS，對(duì)照組20 例為輸卵管因素導(dǎo)致的不孕病人。觀察組入組標(biāo)準(zhǔn)：①稀少排卵或沒有排卵；②有高雄激素血癥或者高雄激素的特點(diǎn)；③超聲檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)卵巢都有≥12個(gè)直徑2～9 mm 的竇卵泡；④臨床資料完整者。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①輸卵管因素導(dǎo)致的不孕病人；②基礎(chǔ)激素水平正常、月經(jīng)規(guī)律；③有＞5個(gè)雙側(cè)竇卵泡；④近半年沒有使用過甾體激素類藥物；⑤病人注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）當(dāng)日有5個(gè)以上直徑≥14 mm的卵泡；⑥臨床資料完整者。病人排除標(biāo)準(zhǔn)：①最近進(jìn)行過任何維生素類等抗氧化藥物治療的病人；②染色體異常、有子宮內(nèi)膜病變；③排除有精神疾病及性傳播病史；④由于男方原因不孕的病人；⑤子宮內(nèi)膜異位癥、子宮畸形、卵巢囊腫、卵巢腫瘤。病人或其近親屬對(duì)本研究知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性卵巢刺激 觀察組中月經(jīng)不規(guī)律病人應(yīng)用一次黃體酮撤退性出血，于月經(jīng)第3 天實(shí)施醋酸環(huán)丙孕酮治療。重組人促卵泡激素或者人絕經(jīng)期促性腺激素，進(jìn)行控制性刺激卵巢?？刂菩月殉泊碳さ姆桨福捍傩韵偌に蒯尫偶に丶?dòng)劑（GnRHA）方案（拮抗劑方案），Gn 啟動(dòng)劑量100～200 IU/d。監(jiān)測(cè)過程以調(diào)節(jié)Gn為主，逐漸增量，一次增量37.5～75.0 IU，應(yīng)用GnRH-A+HCH降量雙扳機(jī)防止卵巢過度刺激綜合征。對(duì)照組處理方案：亦采用GnRH-A方案（拮抗劑方案）。采用經(jīng)陰道B超測(cè)定病人卵泡以及子宮內(nèi)膜的生長情況。當(dāng)出現(xiàn)2 個(gè)直徑≥18 mm的卵泡時(shí)，應(yīng)立即停止促性腺素的使用，并對(duì)促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、睪酮（T）水平進(jìn)行抽血檢測(cè)，當(dāng)天進(jìn)行注射HCG，在HCG 注射后的34～36 h進(jìn)行取卵。

1.2.2 體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）取卵后，在卵泡液中取出卵-冠-丘復(fù)合物，通過卵母細(xì)胞成熟度分型與精卵進(jìn)行培養(yǎng)，在受精后的12～14 h 對(duì)受精狀況進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行1 d受精后，對(duì)受精卵的卵裂狀況進(jìn)行評(píng)估，在受精后第3 天，將胚胎放置到宮腔內(nèi)。之后進(jìn)行黃體酮注射60 mg/d，第14～16 天后進(jìn)行尿妊娠試驗(yàn)或者對(duì)血清β-HCG進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定為陰性的病人停止使用黃體酮，測(cè)定為陽性的病人進(jìn)行黃體酮的繼續(xù)使用，移植1 個(gè)月后采用經(jīng)陰道超聲檢測(cè)妊娠結(jié)果，注射黃體酮直至移植后10～12周。

1.2.3 精子卵漿內(nèi)注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）采卵后，將卵-冠-丘復(fù)合物從卵泡液中取出，并于在采卵后4 h以去顆粒細(xì)胞的方式處理卵母細(xì)胞，卵胞質(zhì)內(nèi)ICSI 注射單個(gè)精子，16～18 h后，對(duì)受精情況進(jìn)行檢測(cè)，受精后1～2 d 內(nèi)對(duì)卵裂情況進(jìn)行評(píng)估，在受精3 d 后，將胚胎放置到宮腔內(nèi)。其他步驟與IVF-ET一致。

1.2.4 卵泡液收集 取卵日采用陰道超聲對(duì)卵泡進(jìn)行穿刺，收集卵泡液，進(jìn)行離心，將上清液收集在離心管中。按照可見分光度法對(duì)總TAC進(jìn)行測(cè)定，按照硫代巴比妥酸法對(duì)MDA進(jìn)行測(cè)定，按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法對(duì)褪黑素水平進(jìn)行測(cè)定；分別采用葡萄糖氧化電極法、放射免疫法測(cè)定病人空腹血糖（FSG）以及空腹胰島素（FINS）水平，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（ISI），ISI＝1/（FSG×FINS）。全部操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不孕病人50例觀察組和對(duì)照組基本資料比較

2 結(jié)果

2.1 兩組病人基本資料比較調(diào)查結(jié)果顯示，兩組病人年齡、體質(zhì)量（BMI）指數(shù)、不孕年限、不孕類型以及受精方式均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故可排除上述因素對(duì)研究結(jié)果造成的影響，數(shù)據(jù)具有可比性，見表1。

2.2 兩組病人基礎(chǔ)激素水平比較觀察組病人LH、T水平高于對(duì)照組，F(xiàn)SH、E2水平低于對(duì)照組，兩組間基礎(chǔ)激素水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不孕病人50例觀察組和對(duì)照組基礎(chǔ)激素水平比較/

表2 不孕病人50例觀察組和對(duì)照組基礎(chǔ)激素水平比較/

注：LH 為促黃體生成素，T 為睪酮，F(xiàn)SH 為血清卵泡刺激素，E2為雌二醇

2.3 兩組病人胰島素水平比較觀察組病人FINS水平高于對(duì)照組、ISI 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組病人FSG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 不孕病人50例兩組空腹血糖和空腹胰島素水平比較/

表3 不孕病人50例兩組空腹血糖和空腹胰島素水平比較/

注：FSG為空腹血糖，F(xiàn)INS為空腹胰島素

2.4 兩組病人褪黑素水平比較觀察組病人褪黑素水平（120.71±9.32）pg/mL 低于對(duì)照組（138.39±11.03）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.105，P＜0.05）。

2.5 兩組病人卵泡液中氧化/抗氧化能力指標(biāo)比較觀察組病人TAC水平低于對(duì)照組，觀察組病人MDA 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 不孕病人50例觀察組和對(duì)照組卵泡液中氧化/抗氧化能力指標(biāo)比較/（pg/mL，）

注：TAC為總抗氧化能力，MDA為丙二醛

2.6 卵泡液褪黑素與氧化應(yīng)激指標(biāo)間的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，卵泡液褪黑素水平與TAC水平呈正相關(guān)（r＝0.705，P＜0.05），未發(fā)現(xiàn)卵泡液褪黑素水平與MDA 水平之間的相關(guān)性（r＝-0.110，P＞0.05）。

3 討論

目前有關(guān)PCOS的具體產(chǎn)生機(jī)制還沒有完全明確。大量研究證實(shí)，PCOS 卵母細(xì)胞質(zhì)量降低很大程度上與氧化應(yīng)激相關(guān)，推測(cè)PCOS 的產(chǎn)生因素之一是由于氧化應(yīng)激，引發(fā)卵母細(xì)胞質(zhì)量變差的主要因素或許是氧化損傷［10-12］。病人卵泡液中氧化應(yīng)激水平升高，且與卵母細(xì)胞中紡錘體缺失比例增多有關(guān)，致使其受精率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率降低，推測(cè)過氧化損傷可能是卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的原因之一［13-14］。褪黑素屬于吲哚類的神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一，其分布范圍較廣，在多種生物體內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)。研究表明，褪黑素的分泌會(huì)受到多種外界因素的影響（光照等），能夠根據(jù)外界環(huán)境發(fā)生的變化而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性生理的過程進(jìn)行調(diào)控，在生物的生長、發(fā)育、繁殖過程中均扮演重要角色［15-17］。較早研究結(jié)果指出，褪黑素的主要功能為調(diào)控體內(nèi)晝夜節(jié)律，隨著科技的發(fā)展與研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)褪黑素屬于強(qiáng)效的內(nèi)源性抗氧化劑之一，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的卵泡發(fā)育、性發(fā)育且在維持妊娠方面具有十分重要的作用。臨床研究證實(shí)，褪黑素在卵泡液中的表達(dá)較高。近年來，有學(xué)者提出卵泡液中的褪黑素能夠保護(hù)卵母細(xì)胞使其免受氧化應(yīng)激損傷。

多囊卵巢綜合征屬于一類多見的生育年齡婦女的內(nèi)分泌和代謝異常所出現(xiàn)的疾病，卵泡液成分以及水平的改變對(duì)婦女生殖功能有十分關(guān)鍵的作用［18-20］。研究人員以SD大鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)采取摘除松果體或長時(shí)間的光照等方式能夠?qū)ν屎谒氐姆置谄鸬揭种谱饔?，?dǎo)致大鼠出現(xiàn)PCOS 的癥狀以及病理改變。目前針對(duì)PCOS病人卵泡液中褪黑素濃度是否有變化在國內(nèi)外的研究中均較為少見，因此，本研究對(duì)PCOS 病人卵泡液中褪黑素水平與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，探討其是否參與了PCOS 卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。研究表明，觀察組病人卵泡液中褪黑素表達(dá)降低、TAC 表達(dá)下降、MDA表達(dá)上升；而且，病人卵泡液中褪黑素表達(dá)與TAC呈正相關(guān)關(guān)系。該結(jié)果說明在PCOS病人的卵泡液褪黑素與TAC呈正相關(guān)，提示褪黑素可能為卵泡液中重要的抗氧化劑，具有保護(hù)卵母細(xì)胞使其避免受氧化應(yīng)激損害的作用，在卵泡發(fā)展過程中扮演重要角色［21，22］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 病人可能有卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，且該類病人卵泡液中MET 水平降低，卵泡液中MET 水平與TAC 成正相關(guān)，即MET 可能參與了PCOS 病人卵母細(xì)胞過氧化損傷，這些研究結(jié)果與本研究可以相互印證。

多囊卵巢綜合征病人的卵母細(xì)胞由于其受到氧化應(yīng)激損害，并引發(fā)卵母細(xì)胞質(zhì)量變差，從而對(duì)治療效果產(chǎn)生嚴(yán)重影響，推測(cè)可能與卵泡液中褪黑素水平的降低具有一定的關(guān)系，這為PCOS 的發(fā)病因素的研究及診治提供了科學(xué)的依據(jù)。因此對(duì)褪黑素在PCOS發(fā)病中的具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究探索，為提升PCOS病人的診治提供新的治療思路。