宋清蓮，譚玉娥，劉京京，袁貝貝，李 敏，賀禮琴，戴光榮

延安大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，陜西 延安 716000

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種與肥胖、2型糖尿病密切相關(guān)的代謝性肝損傷疾病[1]。近年來，NAFLD發(fā)病率逐年上升，它不僅累積肝臟本身損害，而且還涉及肝外臟器損害[2]，其帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)逐年上升[3]。美國一項(xiàng)最新大規(guī)模前瞻性研究[4]表明，確診為NAFLD的肥胖患者與90%的惡性腫瘤相關(guān)，其中與肝癌最為密切,胰腺癌次之。因此早期發(fā)現(xiàn)疾病危險因素并干預(yù)對患者肝外并發(fā)癥的發(fā)生至關(guān)重要。目前國內(nèi)外有關(guān)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝外相關(guān)臟器病理改變報(bào)道較少，本文通過成功構(gòu)建NASH大鼠模型，觀察胰腺和腎臟病理組織學(xué)變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 4～5周齡SD雄性大鼠20只，SPF級，體質(zhì)量80～120 g，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號：SCXK(陜)2018-001。在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，置于室溫 18～22 ℃、濕度 45%～65%的受控條件下,光照和黑暗各 12 h 模擬晝夜交替的清潔動物房內(nèi)。 本研究方案經(jīng)由西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審批(批號：XJTULAC2019.993)，符合實(shí)驗(yàn)室動物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 動物分組及建模 所有SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將20只SD大鼠中的6只首先按完全隨機(jī)配對分配到觀察組(B組)，然后將剩下的14只按體質(zhì)量配對成7個區(qū)組，最后將每個區(qū)組中的1只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分配到實(shí)驗(yàn)組(C組)，其余7只為對照組(A組)。B組和C組給予高脂飲食，A組給予普通飲食。B組于實(shí)驗(yàn)第4、8、12周各處死2只，提取肝組織用4%中性甲醛溶液固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片并染色，顯微鏡下觀察肝臟病理切片是否達(dá)到NASH，第12周末NASH建模成功(提示C組建模成功)。

1.3 飼料與配方 高脂飲食配方：81.8%普通飼料+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉+10%豬油+5%蛋黃+0.2%丙基硫氧嘧啶；普通飼料和高脂飼料均購買于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：JL20180925312E。將普通飼料和高脂飼料混合均勻后壓制成條，59 ℃烘干。

1.4 主要材料與試劑 鼠抗大鼠Desmin抗體(Servicebio)、大鼠ALT Elisa試劑盒、AST Elisa試劑盒、GGT Elisa試劑盒、甘油三酯(TG)Elisa試劑盒、總膽固醇(TC)Elisa試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)Elisa試劑盒(上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司)，葡萄糖(GLU)Elisa試劑盒(上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司)，胰島素(INS)Elisa試劑盒(上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司)，成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.5 樣本收集與處理 實(shí)驗(yàn)第4、8、12周末各隨機(jī)抽取B組2只大鼠禁食不禁水12 h后處死，抽取約5～8 ml下腔靜脈血,以3000 r/min離心5 min，離心出血清儲存在-80 ℃冰箱，測血清 ALT、AST、GGT、TG、LDL、TC、GLU、INS水平；迅速完整分離出肝臟，肉眼觀察肝臟大體形態(tài)及顏色,取肝臟組織固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，HE染色；第12周末B組大鼠建模成功，禁食12 h后處死A組和C組全部大鼠，血樣處理同B組第4、8周末；取肝臟、胰腺、腎臟組織固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作病理切片，HE染色觀察肝細(xì)胞、腺泡細(xì)胞以及胰島變化情況，PAS染色和免疫組織化學(xué)desmin蛋白染色觀察腎小球和足細(xì)胞變化情況。由經(jīng)驗(yàn)豐富的2名病理醫(yī)師通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行雙盲性觀察。每張肝組織HE切片隨機(jī)進(jìn)行5個視野觀察,并對肝組織脂肪變、炎癥程度、氣球樣變評分。其中,肝組織的脂肪變診斷參考《非酒精性脂肪性肝病中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見(2017年)》[5]進(jìn)行NAFLD活動度積分(NAS)和肝纖維化分期。

1.6 檢測指標(biāo)和方法 血液在室溫下自然凝固10～20 min并離心約20 min(2000～3000 r/min)。收集上清液，按ALT、AST、GGT、LDL、TG、TC、GLU、INS Elisa 試劑盒說明進(jìn)行操作，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR，HOMA-IR=GLU×INS/22.5。

1.7 Desmin蛋白表達(dá)測定 采用免疫組化平均光密度值半定量分析方法測定desmin蛋白在腎臟表達(dá)水平：每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選3個400倍視野進(jìn)行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD)以及組織的像素面積(AREA)。并求出平均光密度值(average optical, AO值)，AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達(dá)水平越高。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清生化指標(biāo)變化 C組大鼠血清ALT、GGT、TG、TC、LDL、GLU、INS、HOMA-IR水平及肝臟病理評分均高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 A組與C組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

2.2 NAFLD大鼠臟器病理改變

2.2.1 肝臟組織病理學(xué)變化 A組第12周末：肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞沿中央靜脈呈放射狀整齊排列，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞之間界限清楚，肝細(xì)胞核居中，胞漿內(nèi)未見脂肪空泡，匯管區(qū)無炎癥細(xì)胞浸潤(圖1a)；B組第4周末：肝小葉結(jié)構(gòu)仍可見，部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較小的脂肪空泡，匯管區(qū)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(圖1b)；B組第8周末：肝小葉結(jié)構(gòu)部分消失，大部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，細(xì)胞之間界限模糊不清，肝竇變窄，匯管區(qū)逐漸出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(圖1c)；C組第12周末：幾乎全小葉內(nèi)出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，胞漿內(nèi)可見較大脂肪空泡，匯管區(qū)可見大量炎癥細(xì)胞(圖1d)。

注：a，A組第12周末；b，B組第4周末，箭頭所示：肝細(xì)胞輕度脂肪變，胞漿內(nèi)可見小的脂肪空泡，匯管區(qū)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；c，B組第8周末，箭頭所示：肝細(xì)胞中度脂肪變，胞漿可見大小不等的脂肪空泡，細(xì)胞界限不清，匯管區(qū)可見炎癥細(xì)胞浸潤；d，C組第12周末，箭頭所示：肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大泡性脂肪空泡，匯管區(qū)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1肝組織病理圖片(HE染色，×400)

2.2.2 腎臟組織病理學(xué)變化 A組第12周末：腎小球毛細(xì)血管基底膜完整清晰，無增厚，腎小球毛細(xì)血管袢呈分葉狀，系膜區(qū)無增生，腎小球囊腔清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，管腔清晰可見(圖2a)；C組第12周末：PAS染色陽性物質(zhì)明顯增多，腎小球體積增大，腎小球囊腔變窄；腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜區(qū)增生明顯；腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔狹窄(圖2b)。

正常情況下，desmin僅在系膜細(xì)胞少量表達(dá)，在足細(xì)胞不表達(dá)，當(dāng)腎小球受到各種損傷因素刺激時，desmin發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并大量表達(dá)。 圖像分析結(jié)果顯示，腎小球足細(xì)胞Desmin蛋白表達(dá)增強(qiáng)(圖2c、d)。

注:a，A組第12周末(PAS，×400)；b，C組第12周末(PAS，×400),箭頭所示：PAS染色陽性物質(zhì)明顯增多；腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜區(qū)增生明顯；腎小球體積增大，球囊變小；腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔狹窄;c，A組第12周末(Desmin蛋白，×400);d，C組第12周末(Desmin蛋白，×400)，箭頭所示：腎小球可見Desmin蛋白(棕黃色陽性物質(zhì))表達(dá)增多。

圖2腎臟組織病理圖片

2.2.3 胰腺組織病理學(xué)變化 A組第12周末：胰腺腺泡及胰島結(jié)構(gòu)完整，腺泡細(xì)胞及胰島細(xì)胞排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤。C組第12周末：胰腺腺泡細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，萎縮，胰島細(xì)胞未見異常(圖3a、b)。

注：a，A組第12周末;b，C組第12周末，箭頭所示：腺泡細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，萎縮，胰島細(xì)胞未見異常。

圖3胰腺組織病理圖片(HE染色,×400)

3 討論

NAFLD的特征在于脂肪在肝細(xì)胞中以含有TG的脂滴形式積累。以TG這種形式積聚被認(rèn)為是發(fā)揮脂毒性之前對機(jī)體的一種保護(hù)方式。當(dāng)TG的大量積聚超過肝臟代謝能力時會引發(fā)肝臟一系列氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。NAFLD時肝臟脂質(zhì)代謝產(chǎn)物增多(如二酰甘油、棕櫚酸酯、神經(jīng)酰胺等)損傷肝細(xì)胞，并激活炎癥細(xì)胞通路(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激等)，使炎癥級聯(lián)反應(yīng)放大，導(dǎo)致NAFLD向NASH轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)疾病發(fā)展[6]?？梢?，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是脂毒性的重要結(jié)果。對轉(zhuǎn)氨酶的分析，轉(zhuǎn)氨酶異常提示肝臟的炎癥反應(yīng)及損傷程度。由于ALT主要存在肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥、壞死等損害使肝細(xì)胞膜通透性改變時，ALT從細(xì)胞內(nèi)溢出到血液中。本研究發(fā)現(xiàn)C組ALT明顯高于對照組(P<0.05)，說明C組大鼠肝細(xì)胞受到了嚴(yán)重?fù)p害，考慮與NAFLD時血漿游離脂肪酸增加，脂肪酸β氧化也相應(yīng)增加，其代謝產(chǎn)物的增多以及炎癥介質(zhì)的釋放，觸發(fā)絲裂原活化蛋白激酶通路和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路活化[7]，啟動細(xì)胞傳導(dǎo)通路，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞功能受損甚至壞死，而壞死的細(xì)胞進(jìn)一步使炎癥細(xì)胞侵入肝實(shí)質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致NASH發(fā)生有關(guān)。因此，氧化應(yīng)激是NASH的主要驅(qū)動力之一。正常情況下，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，ALT首先釋放入血，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，危及線粒體時，AST也釋放入血。當(dāng)AST增高超過ALT時，提示病變的慢性化和進(jìn)展性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)C組AST高于A組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但同時發(fā)現(xiàn)AST水平明顯高于ALT，提示疾病可能向肝硬化方向進(jìn)展。GGT 是在腎臟、胰腺、肝臟、脾臟等組織中發(fā)現(xiàn)的微粒體酶，腎內(nèi)含量最多，其次是胰腺和肝臟[9]。生理?xiàng)l件下，血清中GGT是谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，主要來源于肝臟內(nèi)的肝內(nèi)膽管上皮和肝細(xì)胞胞漿[10],參與谷胱甘肽的代謝。本研究發(fā)現(xiàn)C組大鼠的血清GGT水平明顯升高(P<0.05)，表明肝細(xì)胞受到了嚴(yán)重?fù)p害，考慮與血漿游離脂肪酸增多，使活性氧產(chǎn)生增多，從而促使肝細(xì)胞膜通透性改變，致使肝細(xì)胞受損有關(guān)。對血脂的分析，本研究發(fā)現(xiàn)C組SD大鼠與A組大鼠相比，C組TG、LDL、TC均明顯高于A組(P值均<0.05)，提示脂質(zhì)代謝紊亂,考慮原因?yàn)檫^度高脂飲食攝入使肝臟內(nèi)脂質(zhì)過多積聚,脂肪組織的再分解或合成的游離脂肪酸增多，肝臟脂類代謝能力進(jìn)一步減弱，導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥壞死甚至纖維化；另外，由于高血糖可以促進(jìn)新生脂肪的生成以及胰島素通過激活轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c調(diào)控新生脂肪生成[11]，提示作為NAFLD主要發(fā)病機(jī)制之一的胰島素抵抗，也可能參與了脂質(zhì)代謝紊亂。

最新一項(xiàng)隊(duì)列研究[12]表明，NAFLD能促進(jìn)晚期慢性腎臟病的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食所致的NASH模型影響大鼠腎臟組織學(xué)改變。本研究發(fā)現(xiàn)C組大鼠與A組大鼠相比，PAS染色顯示腎小球體積增大，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜區(qū)增生明顯，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔狹窄；可能與致動脈粥樣硬化性血脂異常導(dǎo)致腎臟內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和腎臟血管損傷有關(guān)，至于是否與足細(xì)胞胰島素抵抗以及氧化應(yīng)激有關(guān)今后仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。其次，低密度脂蛋白氧化產(chǎn)生的氧化低密度脂蛋白有細(xì)胞毒性作用[13]，會刺激系膜細(xì)胞增生，損傷腎臟內(nèi)皮細(xì)胞，增大細(xì)胞通透性，增加細(xì)胞基質(zhì)的分泌，漸而出現(xiàn)腎小球硬化，最終成為慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展基礎(chǔ)。C組大鼠與A組大鼠相比，免疫組化Desmin蛋白表達(dá)增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于正常腎臟幾乎不表達(dá)Desmin蛋白，只有少數(shù)系膜基質(zhì)表達(dá)；當(dāng)腎小球足細(xì)胞受損時，Desmin蛋白表達(dá)明顯增加。因此，Desmin蛋白為足細(xì)胞損傷的標(biāo)志蛋白之一[14]。既往研究[15]表明，腎臟足細(xì)胞是胰島素的敏感細(xì)胞，胰島素抵抗會導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)及功能障礙。一方面，胰島素對腎小管有保鈉作用，高胰島素血癥時，通過激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)促進(jìn)腎臟血流動力學(xué)改變繼而導(dǎo)致腎臟損害[16]。另一方面，足細(xì)胞通過胰島素信號傳導(dǎo)通路維持腎臟功能，Saleem等[17]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠足細(xì)胞胰島素特異性受體會導(dǎo)致蛋白尿和腎小球硬化。所以，猜測胰島素抵抗可能參與本研究足細(xì)胞損傷過程。由于國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，仍需大量體外實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。腎臟的組織學(xué)活檢對明確二者之間關(guān)系提供一定幫助，可進(jìn)一步闡述其具體發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而為臨床醫(yī)生提供新思路。

“脂肪胰” 以胰腺脂肪浸潤或脂肪變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，近年來逐漸成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)。最新研究[18]表明，利用3-T磁共振成像，質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)可以較好的評價胰腺脂肪含量，并且是一種極具應(yīng)用前景的可以預(yù)測胰腺脂肪含量與胰腺癌之間關(guān)系的影像學(xué)檢查。與NAFLD相比，脂肪胰的病理生理機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究[19-20]表明，NAFLD和非酒精性脂肪胰與肥胖密切相關(guān)，且常常并存。Wang等[21]通過一項(xiàng)大規(guī)模橫斷面研究，首次發(fā)現(xiàn)調(diào)整肥胖、相關(guān)心血管危險因素等后,NAFLD仍與脂肪胰獨(dú)立相關(guān)。也有研究[22]發(fā)現(xiàn),脂毒性可能直接介導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞及胰島細(xì)胞病變，致使胰腺內(nèi)外分泌障礙。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食所致的NASH模型可導(dǎo)致大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡、萎縮，甚至壞死，尚未見明顯脂肪浸潤，胰島細(xì)胞未見明顯病變。本研究發(fā)現(xiàn)C組SD大鼠與A組大鼠相比，C組GLU、INS、HOMA-IR均明顯高于A組(P值均<0.05)，再次證實(shí)胰島素抵抗參與NAFLD發(fā)病機(jī)制。由于組織學(xué)表現(xiàn)胰島細(xì)胞未見明顯病變，可見胰島素抵抗參與發(fā)病并不是胰腺直接作用。本研究尚未發(fā)現(xiàn)胰腺脂肪浸潤，可能由于脂肪胰建模時間比NASH更長。對于脂肪胰與胰島細(xì)胞功能之間關(guān)系目前尚無定論[23-24]，是否與胰島素抵抗有關(guān)今后仍需大量研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，NAFLD可導(dǎo)致肝外臟器如腎臟、胰腺病變，為此不僅要重視肝臟本身病變，也要重視肝外臟器損傷，這對于預(yù)防NAFLD潛在的并發(fā)癥至關(guān)重要。