李 楊，和銘鈺，吳長玲，高 悅，王中江，李 萌，江連洲，滕 飛,

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱市食品產業(yè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150000）

大豆種植現(xiàn)已遍布我國各個地區(qū)，主要種植區(qū)域位于東北、華北及長江下游地區(qū)，其中黑龍江為大豆主產區(qū)，產品品質較佳[1-2]。與傳統(tǒng)制油工藝相比，生物酶法制油技術可同時提取油及蛋白，且處理條件溫和，所得產品品質較高；同時，生物酶法制油技術現(xiàn)已實現(xiàn)產業(yè)化，其加工副產物產量可觀但未充分利用，造成嚴重的環(huán)境污染，極大地限制了生物酶法技術的經濟可行性[3-6]。多年來，國內外對豆渣的研究主要集中在多糖、膳食纖維、大豆異黃酮等方面，對豆渣蛋白的研究鮮少[7-8]。因此，生物酶法制油豆渣作為一種營養(yǎng)豐富、天然、低熱量、低脂肪、低糖的食品原料具有很大的發(fā)展?jié)摿9]。

空化微射流技術是一種新型物理改性技術，它集高速沖擊、高頻振動、高速剪切、超微粉碎、瞬時降壓等多種處理技術于一體，從而改變生物大分子物質的物理、化學及結構特性，并提高物質功能活性。近幾年，有研究指出空化微射流處理對于改善蛋白結構具有顯著功效[10-12]。同時，Shen Lan等[13]研究發(fā)現(xiàn)經微射流處理后，熱聚集大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的溶解度及表面疏水性顯著提高，分子間二硫鍵構型改變，并有效改善蛋白乳化特性。Oliete等[12]研究了空化微射流調節(jié)豌豆球蛋白可溶性聚集體的乳化性質，發(fā)現(xiàn)微射流加工過程的空穴效應導致球蛋白聚集體內的結構重排，從而提高了蛋白聚集體的乳液穩(wěn)定性。綜上所述，空化微射流技術能夠對植物蛋白質的理化性質和構象等產生顯著影響，與其他處理技術相比具有操作簡單、處理時間短、溫度低和效果獨特的優(yōu)點，故本研究選用空化微射流技術處理生物酶法制油豆渣。

拉曼光譜是一種基于光散射效應的分子分析技術，具有檢測快速、樣品需要量少且無需預處理及光譜清晰度高等優(yōu)點，已在石油生產、生物醫(yī)藥、環(huán)境污染檢測、寶石鑒定和文物鑒定等領域廣泛應用。與其他光譜相比，拉曼光譜可獲得關于蛋白質二級和三級結構變化的直接信息及其芳香族氨基酸的信息，并且對樣品無破壞性[14-15]。故本研究運用拉曼光譜來分析豆渣蛋白結構。

綜上所述，本研究以生物酶法制油豆渣為原料，運用新型空化微射流技術處理豆渣，探討空化微射流技術對豆渣蛋白結構特性的影響，通過拉曼光譜分析技術深入解析不同處理時間下豆渣蛋白主碳鏈結構及其側鏈基團構象變化，從豆渣蛋白二級結構的變化探討其影響機制。研究旨在充分發(fā)揮空化微射流加工技術的優(yōu)勢，高效回收豆渣蛋白，并改善其功能特性，為豆渣的開發(fā)應用提供技術支持，并為推動大豆副產物高值化進程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物酶法制油豆渣，實驗室自制；堿性蛋白酶Protex-6L（酶活力不小于10 000 U/g） 丹麥丹尼斯克有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

S22-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司； AL204型分析天平、PL303型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DC-500A型高速多功能粉碎機 浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、JJ-1精密增力電動攪拌器 常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；PHS-3C型雷磁pH計 上海精科儀器有限公司； TDL-408型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠； DHG-9146型鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限 公司；空化微射流均質機 東北農業(yè)大學食品學院實驗室；Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 生物酶法制油豆渣的制備

根據(jù)Li Yang等[16]的方法進行適當修改，將市售大豆經粉碎機粉碎過60 目篩，取200 g過篩后的豆粉，按料液比1∶6（m/V）加入蒸餾水，攪拌均勻后放入55 ℃水浴鍋內按照水酶法進行酶解。酶解條件為：酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、pH值維持在9.0、堿性蛋白酶Protex-6L（8 900 U/mL）添加量為0.5%。用攪拌器邊攪拌邊酶解，酶解結束后，取出并用1 mol/L HCl溶液調節(jié)溶液pH值至7.0，之后在100 ℃沸水中滅酶5 min，滅酶后冷卻至室溫，在4 500 r/min、4 ℃條件下離心20 min，去除上層液體，僅保留下層豆渣，并在相同離心條件下按料液比1∶3（m/V）用去離子水將豆渣水洗3 遍，之后將豆渣在平板鋪平后置入55 ℃鼓風烘箱，待質量恒定后取出研磨，即得所需生物酶法制油豆渣。

1.3.2 空化微射流技術處理豆渣

稱取一定量研磨后的豆渣，按料液比1∶8（m/V）溶于去離子水中，采用空化微射流均質機，對其進行均質處理，處理時間分別為5、10 min和15 min，處理溫度25 ℃，壓力0.1 MPa，同時以未經過空化微射流處理（0 min）的樣品作為對照，離心（4 500 r/min、20 min、4 ℃）后沉淀干燥即可。

1.3.3 生物酶法制油豆渣蛋白等電點的確定

根據(jù)馬秀婷[17]的方法進行測定，取過100 目篩的豆渣粉50 g，按料液比1∶22（m/V）加入蒸餾水，45 ℃下用1 mol/L NaOH溶液調pH值至9.5，水浴鍋攪拌提取1 h，pH值維持在9.5。在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液平均分為10 份，用1 mol/L HCl溶液分別調pH值至4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，靜置2 h后在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液后稱質量，重復一次，以pH值為橫坐標、以沉淀蛋白質量/原液質量為縱坐標繪制曲線圖，沉淀量最大時的pH值為豆渣蛋白等電點，從而確定其等電點為4.6。

1.3.4 豆渣蛋白的提取工藝

根據(jù)Tao Xia等[18]的方法進行提取，取100 g豆粉用正己烷以1∶6（m/V）的比例混合攪拌1 h，4 ℃、 4 500 r/min離心20 min，脫脂，得到脫脂豆粕[19]，將脫脂豆粕按1∶20（m/m）的比例與水混合，用2 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至9.0，常溫攪拌2 h后，將其懸浮液在4 ℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液。再用2 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至豆渣蛋白等電點4.6。靜置2 h后在4 ℃條件下7 000 r/min離心30 min，得蛋白沉淀用去離子水洗3 次，最后取沉淀溶解于水中并用2 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至7.0。再在4 ℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液，將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀豆渣蛋白。

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1.3.5 空化微射流技術處理前后豆渣蛋白的拉曼光譜分析

運用Raman Station 400拉曼光譜儀進行測定。激發(fā)光波長7 8 5 n m，激光功率8 0 mW，掃描范圍400～2 000 cm－1，每次掃描時間60 s，積分10 次，4 次掃描進行累加。以苯丙氨酸（（1 003±1）cm－1）作為歸一化因子，作豆渣蛋白的拉曼譜圖。譜圖基線校正、譜峰歸屬查找采用ACD Labs V12軟件。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的實驗至少進行3 次實驗，利用SPSS Statistics 22 軟件，采用方差分析對數(shù)據(jù)進行差異顯著性比較，P＜0.05為顯著性差異。采用Origin 9.5軟件、PeakFit 4.12軟件進行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 豆渣蛋白拉曼光譜分析結果

圖 1 不同空化微射流處理時間下豆渣蛋白拉曼光譜圖Fig. 1 Raman spectra of soybean dreg protein subjected to different durations of cavitation microjet treatment

為了有效分析經空化微射流處理生物酶法制油豆渣中蛋白組分結構特征，采用拉曼光譜技術在400～2 000 cm－1范圍內進行分析研究，結果如圖1所示。依據(jù)已有研究進行各峰位歸屬，分別列于表1中[20]。由于拉曼譜帶的強度與散射中心的數(shù)目成正比，譜帶強度的變化即意味著散射中心（包括基團和化學鍵）數(shù)目的變化。強度變小說明相應譜帶所屬的基團或化學鍵受到損傷。如果譜帶位移，則可能是相應的基團或化學鍵受到影響而發(fā)生變化的緣故。拉曼光譜中譜峰位置及強度的變化主要用于研究豆渣蛋白的二級結構和疏水微環(huán)境的變化。

表 1 豆渣蛋白拉曼光譜特征頻率歸屬Table 1 Raman spectral characteristic frequency attribution of soybean dreg protein

2.2 豆渣蛋白主鏈結構特征拉曼光譜分析結果

圖 2 豆渣蛋白酰胺I區(qū)分峰和迭代擬合曲線Fig. 2 Segregated and iterative curve-fitted Raman bands of soybean dreg protein in amide I region

豆渣蛋白酰胺I帶拉曼特征峰位置為：α-螺旋結構，1 645～1 660 cm－1；β-折疊結構，1 670～1 680 cm－1；β-轉角結構，1 680～1 690 cm－1；無規(guī)卷曲結構，1 660～1 670 cm－1。將1 003 cm－1波段作為歸一化因子，此波段的苯丙氨酸結構穩(wěn)定，不易被外界環(huán)境干擾。各譜中以它的強度作為1，在此基礎上計算了不同空化微射流豆渣蛋白溶液中各個基團的譜帶強度變化率[21-22]。本實驗中豆渣蛋白的拉曼圖譜二級結構的定量計算由PeakFit 4.12軟件完成，圖2所示為豆渣蛋白拉曼譜帶在1 600～1 700 cm－1區(qū)域內的擬合圖譜。

表 2 空化微射流處理豆渣蛋白二級結構組分相對含量Table 2 Relative contents of secondary structure components of soybean dreg protein treated by cavitation microjet %

不同空化微射流處理時間對酰胺I帶豆渣蛋白二級結構相對含量變化情況如表2所示。研究發(fā)現(xiàn)，與未處理豆渣蛋白相比，經空化微射流處理后豆渣蛋白的α-螺旋及β-折疊結構相對含量顯著增加（P＜0.05）。另外，隨空化微射流處理時間延長，豆渣蛋白α-螺旋及β-折疊結構相對含量呈現(xiàn)先增加再降低的變化趨勢，當處理時間達到10 min時，α-螺旋及β-折疊結構相對含量達到最大為69.09%，β-轉角相對含量呈下降趨勢，而無規(guī)卷曲結構相對含量呈先下降再上升的變化趨勢。

上述結果表明空化微射流處理可以破壞蛋白質二級結構中氨基酸局部序列、氫鍵及其他分子間及分子內相互作用基團，從而導致二級結構變化。與未處理豆渣蛋白相比，空化微射流的高速沖擊、振動、剪切作用使分子間相互作用減弱，非極性基團暴露，導致分子間疏水作用減弱并破壞分子間氫鍵，使得豆渣蛋白α-螺旋和β-折疊結構相對含量增加，β-轉角及無規(guī)卷曲結構相對含量下降；另一方面，空化微射流處理使豆渣蛋白分子間有序結構增加，蛋白質聚集，故α-螺旋和β-折疊構象比例升高[23-25]。Sun Cuixia等[10]分析玉米醇溶蛋白在動態(tài)高壓微射流技術處理下分子鏈纏結和聚集，結果表明α-螺旋、β-折疊相對含量分別從57.1%、16.8%增加到59.4%、17.9%，β-轉角相對含量從8.6%下降至5.0%，印證了本研究中α-螺旋和β-折疊相對含量增加，β-轉角相對含量下降的結果。

處理時間達到10 min后，豆渣蛋白α-螺旋及β-折疊結構相對含量降低，無規(guī)卷曲結構相對含量增加。隨著空化微射流時間的延長，豆渣蛋白分子間碰撞停止，繼續(xù)處理，氫鍵作用反而增大，導致α-螺旋和β-折疊結構相對含量下降。同時，豆渣蛋白分子鏈解折疊，導致無規(guī)卷曲這種無序結構相對含量增加。

2.3 豆渣蛋白側鏈結構特征拉曼光譜分析結果

表 3 空化微射流處理豆渣蛋白側鏈基團譜帶強度Table 3 Side chain group band strength of soybean dreg protein treated by cavitation microjet

拉曼光譜中760 cm－1附近的區(qū)域表征色氨酸殘基的微環(huán)境及氫鍵的變化規(guī)律[26-28]。由表3所示，隨著空化微射流作用時間的延長，色氨酸譜帶強度表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。與未處理豆渣蛋白相比，經空化微射流處理后豆渣蛋白拉曼光譜峰強度在760 cm－1附近區(qū)域顯著降低（P＜0.05），表明色氨酸殘基由包埋的疏水環(huán)境轉變?yōu)楸┞对跇O性環(huán)境中，豆渣蛋白分子間疏水作用 減弱[29-30]。然而，當作用時間超過10 min時，色氨酸譜帶強度顯著增加（P＜0.05），表明色氨酸又變?yōu)榘駹顟B(tài)，豆渣蛋白分子間疏水作用增強。Yang Feng等[31]研究了旋轉空化對SPI功能特性的影響，通過測定表面疏水性發(fā)現(xiàn)，旋轉空化可以減少分子間締合，導致SPI結構的展開，疏水區(qū)域的暴露，表面疏水性顯著升高。表明空化作用會使豆渣蛋白分子展開，疏水基團暴露，疏水性氨基酸呈“暴露態(tài)”。

2.3.2 酪氨酸殘基

酪氨酸殘基上對位取代苯環(huán)的呼吸振動和面外彎曲倍頻之間能在830 cm－1和850 cm－1附近形成費米共振雙峰，R值（R＝I850/I830，In表示譜帶在波數(shù)為n時的強度）反映了蛋白質分子中的酪氨酸殘基的暴露與埋藏，是監(jiān)測酪氨酸殘基微環(huán)境的有效探針。當R值在0.7～1.0時，酪氨酸殘基埋藏在分子內部；當R值小于0.3時，表明酪氨酸殘基中存在強氫鍵；當R值大于1.0時，表明酪氨酸殘基暴露在水相或者極性環(huán)境中[32-33]。在本研究中，R值分布在1.10～1.20范圍內，表明豆渣蛋白的酪氨酸殘基暴露于極性環(huán)境中，環(huán)上的羥基氧原子作為中性強度氫鍵的供體和受體。

由表3可知，R值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，表明空化微射流處理可以破壞維持蛋白質三級結構的主要作用力，使豆渣蛋白酪氨酸殘基充分暴露，但隨著處理時間的延長，又會導致酪氨酸殘基暴露程度降低。

2.3.3 脂肪族氨基酸

1 450 cm－1可以表征CH2或CH3從蛋白質側鏈和脂質產生的振動彎曲，是脂肪族氨基酸的拉曼歸屬譜帶[34-35]。由表3可以看出，拉曼光譜中1 450 cm－1的譜帶強度隨著空化微射流時間的延長呈先下降后增加的趨勢。在本研究中，經過5 min的空化微射流處理的、豆渣蛋白拉曼歸屬峰在1 450 cm－1附近區(qū)域顯著降低（P＜0.05），脂肪族氨基酸趨于“暴露態(tài)”，這與豆渣蛋白結構的解折疊及二級結構轉變有關。然而，當作用時間超過10 min時，脂肪族氨基酸譜帶強度顯著增加（P＜0.05），表明脂肪族氨基酸又埋藏在分子內部。

2.4 豆渣蛋白二硫鍵拉曼光譜分析結果

二硫鍵的特征譜帶在500～550 cm－1范圍內，并且與分子內和分子間的巰基/二硫鍵相互轉化有關。二硫鍵在不同振動模式下所反映出來的拉曼位移有所不同，其中，500～515 cm－1處為gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm－1為gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，525～545 cm－1為trans-gauche-trans（t-g-t）模式[36-37]。 為了探究空化微射流對豆渣蛋白二硫鍵的影響，運用Peak Analyzer軟件進行多峰值Guassian擬合。

圖 3 豆渣蛋白拉曼譜帶在490～560 cm－1區(qū)域內的高斯擬合圖Fig. 3 Fitted Gaussian peaks of soybean dreg protein in the region of 490–560 cm-1

表 4 空化微射流處理豆渣蛋白在 500～550 cm－1區(qū)域擬合結果Table 4 Fitting results for soybean dreg protein subjected to cavitation microjet treatment in the 500–550 cm-1 region

從圖3可以看出，重新合成的擬合譜帶與實驗數(shù)據(jù)貼近，證明擬合結果是準確的。對擬合的各個高斯峰值進行歸屬，不同空化微射流處理時間豆渣蛋白二硫鍵的振動模式歸屬如表4所示。經空化微射流處理后，g-g-g和g-g-t模式比例呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，而t-g-t模式比例先增加后下降。隨著空化微射流時間的延長，二硫鍵變化明顯，原因是豆渣蛋白顆粒被破壞，使得包埋在內部的游離巰基被氧化生成二硫鍵，造成蛋白質三級結構變化。這與Oliete等[12]利用動態(tài)高壓流化技術調節(jié)豌豆球蛋白可溶性聚集體，使得游離巰基含量減少，二硫鍵增多結果相似。同時t-g-t模式比例增加，當處理時間達到10 min時，達到最大72.21%，表明豆渣蛋白分子間作用力增強，進而形成一種趨于更穩(wěn)定的結構。隨著時間的延長，t-g-t模式比例降低，表明蛋白質穩(wěn)定性降低，豆渣蛋白分子間作用力減弱。

3 結 論

以生物酶法制油豆渣蛋白為原料，經過不同時間的空化微射流處理，利用拉曼光譜分析豆渣蛋白的各種功能鍵與蛋白質二級結構的變化，發(fā)現(xiàn)空化微射流處理10 min時豆渣蛋白效果最好。結果表明，空化微射流處理提高了豆渣蛋白的α-螺旋及β-折疊結構含量，并降低了β-轉角和無規(guī)卷曲結構；I760、I1450和I850/I830變化表明，疏水性氨基酸殘基暴露程度加深；空化微射流處理改變了豆渣蛋白的二硫鍵構型，g-g-g和g-g-t模式比例降低，以及t-g-t模式比例增加。綜上，空化微射流技術可以改變生物酶法制油豆渣蛋白的二級結構，對其有一定的積極作用，使豆渣蛋白無序結構趨于有序化，提高其穩(wěn)定性，為豆渣蛋白在食品加工過程中的應用提供了一定的理論依據(jù)。