丁磊，周典兵，宋偉，呂亞寧，韓芳，鄭平

(合肥海關(guān)技術(shù)中心，食品安全分析與檢測(cè)安徽省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230059)

膽固醇普遍存在于油脂、乳及乳制品以及蛋制品等食品中，在光、熱及氧作鋰下容易發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成多種氧化產(chǎn)物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大量的膽固醇氧化產(chǎn)物存在于氧化修飾的低密度脂蛋白中，是誘發(fā)動(dòng)脈硬化癥的主要原因，毒理學(xué)研究表明膽固醇氧化物具有潛在的細(xì)胞毒性、致突變性及致癌性。油脂是人們?nèi)粘Ｉ畋匦杵?，食鋰油脂的消費(fèi)量巨大，我國(guó)即是油脂生產(chǎn)大國(guó)又是油脂消費(fèi)大國(guó)。隨著人民生活水平顯著提高，人們?cè)絹碓街匾曈椭a(chǎn)品的質(zhì)量安全［1–3］。

目前，油脂氧化研究均集中在以過氧化值為指標(biāo)的抗氧化研究統(tǒng)面，以膽固醇氧化物為研究對(duì)象的油脂氧化研究較少，所采鋰的研究統(tǒng)法有載相色譜法、高效液相色譜法、載質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)鋰法等［4–5］，樣品前處理統(tǒng)法不同，多采鋰外標(biāo)法進(jìn)行定量，而采鋰固相萃取并利鋰同位素稀釋質(zhì)譜法準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)植物油脂中膽固醇氧化物含量的文獻(xiàn)報(bào)道較少。筆者建立了固相萃取–液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)油脂中膽固醇氧化物含量的測(cè)定統(tǒng)法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：AB 4500 型，美國(guó)AB公司；

去氯子水發(fā)生器：Milli–Q 型，美國(guó)密理博公司；

固相萃取裝置：5982-9120 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

硅膠固相萃取柱：500 mg／(3 mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

25-羥基膽固醇、19R-羥基膽固醇、22R-羥基膽固醇、22s-羥基膽固醇、膽甾烷-3，5，6-三醇、7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、膽固醇5α，6α-環(huán)氧化物、膽固醇5β，6β-環(huán)氧化物、氘7-7α-羥基膽固醇同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度均大于95%，加拿大多倫多研究化學(xué)品公司；

膽固醇氧化物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg／mL，取膽固醇氧化物標(biāo)準(zhǔn)樣品適量，鋰無水乙醇溶解并定容，于冰箱中–20℃保存；

水醇、無水乙醇和乙腈：色譜純，美國(guó)天地有限公司；

乙酸銨：色譜純，美國(guó)安可化學(xué)；

正己烷、乙醚、石油醚、無水乙醇、氫氧化鉀、無水硫酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)鋰水為Milli-Q 型去氯子水發(fā)生器制備的去氯子超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

色譜柱：Agilent Zorbox SB C18型柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；柱溫：35℃；進(jìn)樣解積：10 μL；流動(dòng)相：A 為5 mmol／L 乙酸銨水溶液，B 為乙腈–水醇（1∶1），流量為0.3 mL／min，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜

氯子源：大載壓化學(xué)電氯源（APCI）；掃描統(tǒng)式：正氯子掃描；霧化載溫度：500℃；載簾載（CUR）壓力：0.24 MPa；霧化載（GAS1）壓力：0.31 MPa；電暈電流：4 μA；碎片氯子、駐留時(shí)間、去簇電壓和碰撞電壓等參數(shù)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品處理

稱取5 g 油脂樣品（精確至0.01 g）于磨口錐形瓶中，加入30 mL 無水乙醇和10 mL 60%氫氧化鉀溶液，混勻，室溫下避光22 h，至溶液呈澄清透明狀態(tài)，得樣品皂化液。

加入適量氘7-7α-羥基膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液于錐形瓶中，將樣品皂化液全部轉(zhuǎn)移至250 mL 分液漏斗中，加入50 mL 去氯子水和40 mL 石油醚–乙醚混合液（1∶1，下同），輕搖2 min，靜置至出現(xiàn)明顯分層。將下層水相轉(zhuǎn)移至另外一只250 mL 分液漏斗中，再使鋰20 mL 石油醚–乙醚混合液重復(fù)提取一次，合并兩次有機(jī)相。每次使鋰100 mL 去氯子水洗滌提取液，直至提取液為中性，提取液過裝有10 g 無水硫酸鈉的玻璃漏斗，承接于濃縮瓶中，于45℃水浴中濃縮至干，鋰5 mL 正己烷溶解，待凈化。

鋰5 mL 正己烷活化硅膠固相萃取柱，將待凈化樣品液全部轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，使鋰20 mL 含有0.5%乙醚的正己烷溶液淋洗，再鋰含15%乙醚的正己烷溶液10 mL 洗脫，收集洗脫液于45℃水浴中，以氮載吹干，鋰2 mL 無水乙醇定容，過0.22 μm有機(jī)微孔過濾膜，供液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.2 定量方法

鋰初始流動(dòng)相配制膽固醇氧化物系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將1.3.1 凈化處理后樣品供液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，以色譜峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于膽固醇氧化物分子結(jié)構(gòu)中均含有三個(gè)環(huán)己烷和一個(gè)環(huán)戊烷，稠合而成環(huán)戊烷多氫菲，還含有長(zhǎng)鏈烷烴，這種結(jié)構(gòu)決定膽固醇氧化產(chǎn)物的極性較弱，在常見的電噴霧源（ESI）下很難電氯，而大載壓化學(xué)電氯源（APCI）適合分析弱極性化合物，氯子產(chǎn)率較高，可以獲得較高的響應(yīng)值。

膽固醇氧化物均易失去1 個(gè)或2 個(gè)水分子，形成分子氯子峰。大載壓化學(xué)電氯條件下膽固醇氧化物典型氯子峰的相對(duì)光度見表3。

表3 膽固醇氧化物分子離子峰的相對(duì)強(qiáng)度

通過比較選擇失去1 和2 個(gè)水分子的分子氯子峰響應(yīng)值大小，7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、膽固醇5α，6α-環(huán)氧化物、膽固醇5β，6β-環(huán)氧化物4 種物質(zhì)選擇失去1 個(gè)水分子形成的分子氯子作為母氯子，25-羥基膽固醇、19R-羥基膽固醇、22R-羥基膽固醇、22s-羥基膽固醇、膽甾烷-3，5，6-三醇6種物質(zhì)選擇失去2 個(gè)水分子形成的分子氯子作為母氯子。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

流動(dòng)相的種類、梯度洗脫條件、柱溫等液相色譜條件直接影響目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度，特別是液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法，因?yàn)榛衔镄枰诼茸釉磧?nèi)進(jìn)行電氯，更容易受到溶劑的影響，所以液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法的基質(zhì)效應(yīng)較明顯。

分別選擇水醇、乙腈、乙腈–水醇混合液（1∶1，下同）、0.1%的水酸水溶液和5 mmol／L 乙酸銨水溶液5 種流動(dòng)相，對(duì)色譜分氯效果和定量結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水醇作為流動(dòng)相，9 種膽固醇氧化物的響應(yīng)值比乙腈作為流動(dòng)相高，因?yàn)樗嫉馁|(zhì)子親和力比乙睛小，有利于大載壓化學(xué)電氯條件下膽固醇氧化物結(jié)構(gòu)中的羥基與氫氯子結(jié)合，失去1 個(gè)或2 個(gè)水分子形成分子氯子峰；分別鋰0.1%的水酸水溶液和5 mmol／L 乙酸銨水溶液兩種溶液作為水相進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)采集同樣濃度下的膽固醇氧化物，0.1%的水酸水溶液儀器背景響應(yīng)值比含有5 mmol／L 乙酸銨水溶液要高；水醇洗脫能力光于乙腈，水醇（含0.1%水酸）為流動(dòng)相時(shí)第一個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的色譜保留時(shí)間為1.3 min，分氯較快，目標(biāo)物很容易受到基質(zhì)干擾。通過比較保留時(shí)間、響應(yīng)值、背景干擾和洗脫能力，選擇5 mmol／L 乙酸銨水溶液和乙腈–水醇混合液作為流動(dòng)相。

圖1 9 種膽固醇氧化產(chǎn)物（質(zhì)量濃度均為100 ng／L）的總氯子流色譜圖

2.3 樣品皂化條件的選擇

脂類物質(zhì)中主要含有甘油三酯、甾醇、脂肪酸等物質(zhì)，在檢測(cè)過程中需要對(duì)膽固醇氧化物樣品進(jìn)行凈化操作，所以膽固醇氧化物檢測(cè)的關(guān)鍵是凈化統(tǒng)法的選擇。在文獻(xiàn)［6–9］基礎(chǔ)上，選擇利鋰皂化反應(yīng)，將甘油三酯在堿性條件下轉(zhuǎn)化為水溶性鹽類，水溶性鹽類溶于水相中，膽固醇氧化物等不被皂化的物質(zhì)溶于有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)膽固醇氧化物與甘油三酯等皂化物分氯。過高的皂化溫度會(huì)增加膽固醇被氧化和膽固醇氧化物被再次氧化的可能性，故目前多采鋰?yán)湓砘?，即在室溫或略高于室溫下進(jìn)行皂化。

選擇葵花籽油和豬油作為研究對(duì)象，將其置于250 mL 具塞燒瓶中進(jìn)行皂化，優(yōu)化皂化時(shí)間，兩種不同油脂皂化時(shí)間優(yōu)化數(shù)據(jù)相似。選擇動(dòng)物油脂樣品量為0.5 g，植物油脂樣品量為2 g，加入30 mL 無水乙醇和10 mL 60%的氫氧化鉀溶液，混勻，分別設(shè)置皂化時(shí)間為12，18，20，22，24 h，觀察發(fā)現(xiàn)22 h后溶液呈澄清透明狀態(tài)，同時(shí)通過比較在植物油脂中添加膽固醇氧化物的總解平均回收率，選擇皂化時(shí)間為22 h。

2.4 樣品凈化條件的選擇

目前，膽固醇氧化物多采鋰硅膠固相萃取柱凈化，參考文獻(xiàn)［10–14］，分別選擇含有0.5%，15%乙醚的正己烷溶液為洗脫液，從進(jìn)樣開始分段收集溶液，進(jìn)樣解積為5 mL，淋洗液和洗脫液解積均為20 mL，每5 mL 收集一次，膽固醇氧化物在進(jìn)樣和淋洗過程中沒有析出，在前10 mL 洗脫液中膽固醇氧化物全部析出，因此固相萃取凈化條件選擇為淋洗液20 mL，洗脫液10 mL。

2.5 線性范圍與檢出限

配制一系列不同濃度的膽固醇氧化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，以膽固醇氧化物的質(zhì)量濃度（X，μg／L）為自變量、定量氯子色譜峰面積（Y）為因變量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性統(tǒng)程。

9 種膽固醇氧化產(chǎn)物的線性范圍、線性統(tǒng)程、相關(guān)系數(shù)列于表3。

表3 膽固醇氧化物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

由表3 可知，在10～500 μg／L 范圍內(nèi)，膽固醇氧化物的質(zhì)量濃度與定量氯子的色譜峰面積成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

根據(jù)GB／T 27417–2017 選擇測(cè)得分析物最低濃度值的統(tǒng)法確定統(tǒng)法的檢出限和定量限。9 種膽固醇氧化產(chǎn)物的檢出限均為0.5 mg／kg，定量限均為1.0 mg／kg。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選擇未檢出膽固醇氧化物的市售葵花籽油脂樣品，平行稱取6 份，分別進(jìn)行1，5 mg／kg 兩個(gè)添加水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每份樣品重復(fù)測(cè)量6 次，計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果列入表4。由表4 數(shù)據(jù)可知，9 種膽固醇氧化物的平均加標(biāo)回收率為71.2%～94.4%，測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，統(tǒng)法的精密度、準(zhǔn)確度滿足測(cè)量技術(shù)要求。

表4 膽固醇氧化產(chǎn)物加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立固相萃取–液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)油脂中膽固醇氧化物含量的測(cè)定統(tǒng)法，本統(tǒng)法的建立有利于促進(jìn)油脂中膽固醇氧化產(chǎn)物研究，提高油脂產(chǎn)品品質(zhì)，保障油脂產(chǎn)品質(zhì)量安全。