麻穎垚，郭天文，岳躍成，袁再順,王勇，胡萍*

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴陽 550025；2.貴陽味莼園食品有限公司,貴陽 550600)

醬油是中國傳統(tǒng)的調(diào)味品，是以豆類作為原料，經(jīng)制油、發(fā)酵等程序釀造而成，具有獨特的風(fēng)味，有助于促進食欲[1]；腐敗微生物的存在不僅會影響醬油的外觀與口感，還會產(chǎn)生一系列腐敗現(xiàn)象[2]，如產(chǎn)氣、脹瓶甚至爆瓶等現(xiàn)象，影響醬油的品質(zhì)，進而造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。醬油成分富含氨基酸、糖類、酸類等極易被微生物利用的物質(zhì)，在貯藏過程中的溫度發(fā)生變化時，一些污染菌，特別是產(chǎn)氣類雜菌便會利用醬油成分產(chǎn)生氣體，影響醬油的品質(zhì)與貨架期，對企業(yè)造成巨大損失[4,5]。

PCR-DGGE可以快速、準確探索環(huán)境中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)[6]，胡萍等[7，8]利用該技術(shù)對真空包裝火腿中的微生物檢測發(fā)現(xiàn)主要細菌為清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌；Kim等[9]通過該技術(shù)鑒定出中國豆醬中的主要菌種為芽孢桿菌。

本實驗針對某公司釀造醬油產(chǎn)品出現(xiàn)脹瓶、脹袋現(xiàn)象，利用PCR-DGGE技術(shù)對脹瓶、脹袋醬油中的細菌群落組成進行分析并鑒定主要污染菌群，為醬油的質(zhì)量安全控制提供了依據(jù)，為解決醬油脹袋問題提供了參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

1.1.1 試驗樣品

樣品采自某調(diào)味品生產(chǎn)股份有限公司，共5個樣，儲存于4 ℃下備用，其中A樣品與D樣品脹氣程度一般，C樣品脹氣較嚴重，而B樣品與E樣品嚴重脹氣。

1.1.2 主要試劑

溶菌酶、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-平衡酚、TE緩沖液(pH 8.0)：北京Solarbio公司；溴化乙錠(EB)：美國Sigma公司；PCR引物試劑：由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成；Go Taq Green Master Mix(2X)：美國Promega公司；2000 bp DNA Marker與6×loading buffer：大連Takara有限公司；無水乙醇：重慶川東化工有限公司；實驗所用其他無機試劑、有機試劑(均為分析純)：市售。

1.1.3 主要儀器

P型移液槍 法國Gilson公司；LDZX-50KBS滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；S1000TMThermal Cycler PCR儀、Gel DocXR凝膠成像系統(tǒng)、DcodeTMUniversal Mutation Detection System電泳儀 美國Bio-Rad公司；Micro 17R微量高速冷凍離心機 美國Thermo Electron公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；BC/BD-270SH海爾冰柜 青島海爾股份有限公司；LX-100迷你離心機、HW-80A漩渦混合機 江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；HPX-9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；Master-E實驗室超純水機 上海市和泰儀器有限公司；潔凈臺 蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.1.4 試劑的配制

母液50×TAE：準確稱取Tris 242 g，加入800 mL去離子水，充分攪拌溶解，然后加入57.1 mL冰醋酸，混勻后加入ddH2O定容至1 L，室溫保存。

溶菌酶(50 mg/mL)：準確稱取0.05 g溶菌酶粉末，完全溶解于1 mL無菌雙蒸水中。

瓊脂糖(1.2%)：稱取0.225 g瓊脂糖加入20 mL 1×TAE緩沖液中，微波爐加熱時完全溶解。

10% SDS：稱取10 g SDS，加入90 mL去離子水，加熱68 ℃，加入HCl調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100 mL。

1×TAE：用母液50×TAE稀釋，20 mL母液與980 mL去離子水混合。

0.5×TAE：用母液0.5×TAE稀釋，10 mL母液與990 mL去離子水混合。

CTAB裂解液：Tris 100 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，2% CTAB(W/V)pH 8.0,高壓滅菌，室溫保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品中總DNA的提取方法

樣品中總DNA的提取方法參照文獻[10，11]：取2 mL樣品置于2 mL離心管中離心，富集3次，收集沉淀，取上述沉淀加入300 μL溶菌酶(濃度為50 mg/mL)，混勻后置于37 ℃水浴1 h；然后加入10% SDS 200 μL后置于60 ℃水浴20 min；再加入NaCl，同時加入CTAB裂解液600 μL，置于65 ℃水浴15 min；將上述混合溶液以12000 r/min離心6 min后吸取上清液加入等體積25∶24∶1(Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇)再次以12000 r/min離心6 min；吸取上清液加入等體積的24∶1(氯仿∶異戊醇)，以12000×g離心6 min后收集上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入1/10 NaAc(醋酸鈉)于4 ℃下沉淀3 h后取出，12000×g離心10 min，倒掉上清液，使用冰乙醇洗滌DNA，置于超凈臺無菌風(fēng)干后轉(zhuǎn)入PCR管，加入50 μL TE緩沖液于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增

參照文獻[8]和文獻[11]有所改動，采用嵌套式PCR進行擴增。

第一輪擴增：使用27F[12](AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和1492R(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)通用引物進行16S rDNA全長擴增。反應(yīng)體系(25 μL)：1.5 μL模板DNA，引物(1 μmol/L)各2.5 μL，Go Taq Green Master Mix(2X)12.5 μL，雙蒸水6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25個循環(huán)，最終72 ℃延伸2 min。

第二輪擴增：使用GC-338F[13](GC夾-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)引物以第一輪PCR產(chǎn)物進行擴增，反應(yīng)體系為25 μL(同上)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃退火溫度從65 ℃降至55 ℃，每個循環(huán)降低0.5 ℃，退火時間為3 s，72 ℃延伸1 min，20個循環(huán)；恒定退火溫度下進行94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)。

第三輪擴增：使用不含GC夾的引物338F(ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R引物對第二輪PCR產(chǎn)物進行Reconditioning PCR，減少PCR過程中產(chǎn)生的異構(gòu)二聚體[14]，反應(yīng)體系為25 μL(同上)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min，共5個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

采用Bio-Rad DcodeTMUniversal Mutation Detection System對樣品16S rDNA的V3區(qū)擴增產(chǎn)物進行電泳，電泳條件：8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度30%～60%(100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，凝膠置于0.5×TAE緩沖液中，先在200 V下預(yù)電泳10 min，然后85 V恒電壓下電泳16 h，溴化乙錠(ethidium bromide,EB)染色后放于凝膠成像儀內(nèi)拍照。

1.2.4 回收條帶及DNA測序

將EB染色的DGGE膠片放置于紫外燈下，無菌操作切下DGGE膠上不同位置的條帶，分別放入2 mL離心管中，加入20 μL無菌雙蒸水，在4 ℃下過夜。取1.5 μL為模板DNA進行16S rDNA V3可變區(qū)域擴增(條件PCR第二輪擴增)，PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE后證明與所割條帶位于相同的遷移位置，再割膠回收，4 ℃過夜后取2 μL為模板DNA擴增(條件PCR第三輪擴增)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。登錄NCBI將所得序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行相似性比對。

2 結(jié)果與討論分析

2.1 結(jié)果

脹袋醬油細菌DGGE指紋圖譜結(jié)果見圖1。

圖1 細菌DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE fingerprint spectrum of bacteria

注：一個泳道代表一個樣品，泳道中每一條亮帶代表一種細菌，不同位置的條帶代表不同種類，條帶越亮，所代表的種屬細菌相對含量越多。

由圖1可知，不同包裝工藝的脹袋醬油所分離出的條帶各不相同，樣品條帶總共18條，其中條帶1，2，6，15，16，17，18在5個樣品中較亮，條帶17最亮，樣品中細菌多樣性豐富；經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對，條帶所代表的細菌鑒定結(jié)果見表1。

表1 樣品條帶測序結(jié)果Table 1 Band sequencing results of samples

由圖1和表1可知，樣品中共分離出了不同亮度的18條條帶，回收條帶的同源性均在93%～99%之間，具有較豐富的細菌種群；其中2，4，5，6為樣品A，B共有條帶；15為B，C樣品共有條帶，B樣中15號菌種含量較少；17為B，C，D樣品共有條帶，D中17號菌種含量較少；條帶1～18所代表的微生物見表1。

DGGE圖譜顯示，A樣品條帶中1，2，6最亮，其次是4，5，11，表明A樣品中優(yōu)勢菌為嗜鹽乳桿菌(Lactobacillushalopiluus)和Lactobacillusparafarraginis1，其次是不可培養(yǎng)乳桿菌1(UnculturedLactobacillussp.)、破布子乳桿菌1(Lactobacilluspobuzihii)和乳酸桿菌屬3(Lactobacillussp.)；B樣品條帶中17最亮，其次是2，6，最后是4，5，11，表明B樣品中優(yōu)勢菌為破布子乳桿菌4(Lactobacilluspobuzihii)，其次是嗜鹽乳酸桿菌(Lactobacillushalopiluus)和Lactobacillusparafarraginis1，最后是不可培養(yǎng)乳桿菌1(UnculturedLactobacillussp.)、破布子乳桿菌1(Lactobacilluspobuzihii)和乳酸桿菌屬3(Lactobacillussp.)；C樣品條帶中17最亮，其次是15，表明C樣品中優(yōu)勢菌為破布子乳桿菌4(Lactobacilluspobuzihii)，其次是嗜酸乳桿菌(Lacobacillusacidipiscis)；D樣品條帶中9，12最亮，其次是7，13，最后是17，表明優(yōu)勢菌為食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)、白葡萄球菌(Staphylococcusarlettae)，其次是Weissellaconfusa、不可培養(yǎng)細菌(UnculturedBacterium)，最后是破布子乳桿菌4(Lactobacilluspobuzihii)；E樣品條帶中18最亮，其次是16，最后是3，8，10，14，表明優(yōu)勢菌為Lactobacillusparafarraginis2，其次是破布子乳桿菌3(Lactobacilluspobuzihii)，最后是乳酸桿菌屬1(Lactobacillussp.)、乳酸桿菌屬2(Lactobacillussp.)、Lactobacillusparafarraginis1和破布子乳桿菌2(Lactobacilluspobuzihii)。

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains

通過菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果(見圖2)，可將測序結(jié)果分為3個類別：類別I為不可培養(yǎng)乳桿菌(UnculturedLactobacillussp.)、Lactobacillusparafarraginis、Weissellaconfusa、乳酸桿菌屬(Lactobacillussp.)、白葡萄球菌(Staphylococcusarlettae)、破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)、不可培養(yǎng)細菌(UnculturedBacterium)，包含條帶有4，6，7，3，8，12，11，5，13；類別II為食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)、破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)、嗜鹽乳桿菌(Lactobacillushalopiluus)，包含條帶有9，17，15，1，2；類別III為破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)、Lactobacillusparafarraginis，包含條帶有16，10，14，18。

2.2 討論分析

本研究利用PCR-DGGE技術(shù)在對5個不同的脹袋醬油樣品進行分離鑒定，檢測出了不同強度和數(shù)量的條帶，通過結(jié)果可看出脹袋醬油中細菌組成較為豐富，并鑒定出多種細菌，有破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)、嗜鹽乳酸桿菌(Lactobacillushalopiluus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)、食竇魏斯氏乳酸桿菌(Weissellacibaria)和白葡萄球乳酸桿菌(Staphylococcusarlettae)等。樊君等人在對脹袋、脹瓶醬油中產(chǎn)氣微生物的傳統(tǒng)分離中發(fā)現(xiàn)了一株產(chǎn)氣非芽孢的短桿菌，張小麗[15]在對脹袋醬油中產(chǎn)氣微生物進行傳統(tǒng)分離時也發(fā)現(xiàn)了一株非芽孢的短桿菌，經(jīng)鑒定指出該菌為破布子乳桿菌，革蘭氏陽性菌，屬于兼性厭氧型微生物，并指出脹袋醬油中的產(chǎn)氣微生物之一即為破布子乳桿菌；李娜在對脹罐醬油中污染微生物進行分離鑒定時發(fā)現(xiàn)脹罐醬油中的破布子乳桿菌含量高于正常醬油含量；楊卓等[16]對廣州某醬油廠的脹罐醬油進行產(chǎn)氣菌研究時，通過16S rDNA測序發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣菌為破布子乳桿菌，并發(fā)現(xiàn)該菌株只有在醬油中培養(yǎng)才會出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象；破布子乳桿菌最早發(fā)現(xiàn)于臺灣的一種名為破布子的食物中，主要用于食品破布子的發(fā)酵[17]，破布子乳桿菌屬于植物乳桿菌的一種，不是致病菌，但該菌大量存在于醬油中會導(dǎo)致醬油脹罐，嚴重影響醬油的質(zhì)量。在本研究的5個脹袋、脹瓶醬油樣品中均發(fā)現(xiàn)了破布子乳桿菌的存在，并且在脹袋嚴重的樣品B，C，E中破布子乳桿菌的濃度最高，綜上可以推斷出破布子芽孢桿菌為脹袋醬油的主要污染微生物。

在脹袋醬油中，除破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)以外，還發(fā)現(xiàn)了嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)、嗜鹽乳酸菌(Lactobacillushalopiluus)、Lactobacillusparafarraginis、乳酸桿菌屬(Lactobacillussp.)、食竇魏斯氏乳酸桿菌(Weissellacibaria)、Weissellaconfusa、白葡萄球乳酸桿菌(Staphylococcusarlettae)，這些菌株在醬油生產(chǎn)過程中均存在：在Yasushi等[18]對醬油生產(chǎn)過程中微生物區(qū)系變化的研究中，在醬油曲中發(fā)現(xiàn)了食竇魏斯氏乳酸桿菌(Weissellacibaria)、Weissellaconfusa的存在，而且在醬油的生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬為優(yōu)勢微生物，并且在醬油發(fā)酵第6周時還發(fā)現(xiàn)了白葡萄球乳酸桿菌(Staphylococcusarlettae)；而嗜酸乳桿菌最初是從泰國的發(fā)酵魚食品中分離篩選出的[19]，并且作為日本傳統(tǒng)發(fā)酵魚食品的優(yōu)勢菌株被檢測出[20]；嗜鹽乳酸菌在醬油生產(chǎn)中的存在可以賦予醬油良好的風(fēng)味，羅立新等[21]從傳統(tǒng)釀造工藝的中國醬油發(fā)酵醬醪中分離篩選出嗜鹽乳酸菌，并且該菌株與Lactobacillusparafarraginis在四川泡菜中也被分離出[22]。

本實驗中所采用的醬油樣品均為包裝完成樣品，而在結(jié)果中除發(fā)現(xiàn)部分污染細菌外，還發(fā)現(xiàn)了一些制曲、發(fā)酵過程中的微生物，說明工廠車間的滅菌效果不佳；2005年，郭天文等通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測發(fā)現(xiàn)引起醬油產(chǎn)氣的細菌污染源于自然環(huán)境中，即使車間封閉仍會有外來微生物的污染，并指出對醬油進行超高溫瞬時殺菌能達到商業(yè)殺菌的目的，有效殺死醬油中的產(chǎn)氣微生物，控制醬油的脹袋、脹瓶現(xiàn)象。

3 結(jié)論

PCR-DGGE可以不通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法直接檢測樣品中微生物的種類，此方法可以快速、準確探索樣品中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化，本實驗利用該方法檢測出脹袋、脹瓶醬油中的污染微生物多樣性豐富，主要為乳酸桿菌屬，經(jīng)鑒定，分析其產(chǎn)氣微生物主要為破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)，除此之外，還發(fā)現(xiàn)一些來源于醬油曲和發(fā)酵過程中的微生物，如食竇魏斯氏乳酸桿菌、Weissellaconfusa和白葡萄球乳酸桿菌，很可能是醬油生產(chǎn)過程中滅菌不徹底造成的，因此在醬油生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中，除了工廠車間滅菌之外，更應(yīng)嚴格把控醬油產(chǎn)品的滅菌過程，避免滅菌不徹底引起的脹袋、脹瓶等嚴重影響產(chǎn)品品質(zhì)的現(xiàn)象出現(xiàn)。