于亞輝，方婷

(福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002)

鮑魚(yú)，素有“軟黃金”的美譽(yù)，同時(shí)也是八珍之首，我國(guó)是鮑魚(yú)養(yǎng)殖大國(guó)，根據(jù)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，全國(guó)鮑魚(yú)年產(chǎn)量自2008年到2017年的9年間，從3.30萬(wàn)噸增長(zhǎng)到14.85萬(wàn)噸，增加了350%，已成為我國(guó)沿海養(yǎng)殖業(yè)的重要組成成分[1，2]。在鮑魚(yú)的加工過(guò)程中，對(duì)產(chǎn)生的鮑魚(yú)內(nèi)臟和鮑魚(yú)殼的研究開(kāi)發(fā)已經(jīng)開(kāi)展了很多年[3]，但是對(duì)富含肽類及游離氨基酸的鮑魚(yú)預(yù)煮液的研究開(kāi)發(fā)較少[4]。

本實(shí)驗(yàn)首先研究了鮑魚(yú)蒸煮液中游離氨基酸的組成及多肽含量，并以其為反應(yīng)基液添加一定的氨基酸和還原糖等風(fēng)味前體物質(zhì)，通過(guò)美拉德反應(yīng)制備海鮮風(fēng)味基料，以感官評(píng)價(jià)為考核指標(biāo)[5-7]，研究了葡萄糖添加量、精氨酸添加量、甘氨酸添加量、組氨酸添加量、半胱氨酸添加量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH等條件下對(duì)風(fēng)味基料的影響，對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，最后對(duì)其風(fēng)味成分進(jìn)行分析[8]。在提高鮑魚(yú)蒸煮液附加值的同時(shí)，為海鮮風(fēng)味基料的制備提供了參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

鮑魚(yú)蒸煮液：詔安海聯(lián)食品有限公司。

葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、半胱氨酸、Gly-Gly-Tyr-Arg：西格瑪試劑公司；雙縮脲試劑：上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、三氯乙酸：國(guó)藥試劑公司；孔徑0.45 μm濾膜：天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；磷酸鹽緩沖液：自制。

AX523ZH精密電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；雷磁PHS-3C型pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Centrifuge 5430R小型高速冷凍式離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 鮑魚(yú)蒸煮濃縮液的制備

鮑魚(yú)蒸煮液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，55 ℃旋蒸去掉45%的水。

1.2.2 游離氨基酸的測(cè)定[9]

全自動(dòng)氨基酸分析儀參數(shù)：日立離子交換樹(shù)脂(4.6 mm×60.0 mm)；測(cè)定波長(zhǎng)為570，440 nm；緩沖液流速0.5 mL/min；柱溫20～85 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 多肽含量的測(cè)定[10]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：使用體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸將Gly-Gly-Tyr-Arg四肽配制成0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后取 6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入4.0 mL雙縮脲試劑，混勻，靜置10 min，6000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值，以肽的濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，OD值為縱坐標(biāo)Y制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品多肽的測(cè)定：取鮑魚(yú)蒸煮濃縮液5.0 mL，加入5.0 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，混勻，靜置10 min，6000 r/min 離心10 min，將上清液倒入25 mL容量瓶中，并用5%的三氯乙酸定容，然后取6.0 mL樣品加入4.0 mL雙縮脲試劑混勻，靜置10 min，然后6000 r/min 離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得鮑魚(yú)蒸煮濃縮液中的多肽濃度(mg/mL)。

1.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

頂空固相微萃取條件：選用75 μm CAR/PDMS萃取頭，萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間20 min，解吸時(shí)間5 min。

色譜條件：氣相色譜柱：RTX-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×25 mm×0.25 mm)；柱溫：初始溫度40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至260 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：氮?dú)?；流量?.0 mL/min；分流比：10∶1；質(zhì)譜條件：采集方式：全掃描；質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍：35～450 amu；電離方式：電子轟擊(EI)；發(fā)射能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃；接口溫度：260 ℃。

1.2.5 風(fēng)味基料的制備

取30 mL鮑魚(yú)蒸煮濃縮液，依次按比例加入葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、半胱氨酸攪拌均勻，并使用磷酸鹽緩沖溶液及氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至一定pH，裝入美拉德反應(yīng)瓶(厚壁耐壓瓶)后置于立式壓力蒸汽滅菌器中，在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

表1結(jié)合表2的基本配方，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1和表2。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Single factor experimental design table

表2 制備風(fēng)味基料基本配方及反應(yīng)條件Table 2 Basic formula and reaction conditions for preparing flavor basic material

1.2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以感官評(píng)價(jià)為考慮依據(jù)，選擇在反應(yīng)條件及氨基酸添加量中對(duì)風(fēng)味基料品質(zhì)影響較大的因素，反應(yīng)pH(A)、精氨酸添加量(B)、甘氨酸添加量(C)、半胱氨酸添加量(D)4個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化，因素及水平選取見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.8 感官評(píng)價(jià)方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)20名感官評(píng)價(jià)人員進(jìn)行培訓(xùn)，選取10名人員組成感官評(píng)價(jià)小組對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，每個(gè)樣品重復(fù)2次，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表4，滿分100分，最后取10名評(píng)價(jià)人員的平均分?jǐn)?shù)為最終結(jié)果。

表4 風(fēng)味基料評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Evaluation standards of flavor basic material

2 結(jié)果與分析

2.1 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線及多肽含量測(cè)定

以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽的濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，OD值為縱坐標(biāo)Y制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。得到回歸方程y=0.0975x+0.0159，R2=0.9961。測(cè)得樣品的OD值為0.0573，計(jì)算得鮑魚(yú)蒸煮濃縮液的多肽含量為0.425 mg/mL。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg tetrapeptide

2.2 氨基酸組成成分分析

本實(shí)驗(yàn)采用的標(biāo)樣為37種氨基酸標(biāo)樣，盡可能全面分析鮑魚(yú)蒸煮濃縮液中氨基酸的組成成分，其中脯氨酸和羥脯氨酸在波長(zhǎng)440 nm處出峰，其他35種氨基酸在波長(zhǎng)570 nm處出峰。

表5 樣品中37種游離氨基酸含量Table 5 Content of 37 free amino acids in sample

續(xù) 表

由表5可知，鮑魚(yú)蒸煮濃縮液中氨基酸種類豐富，但含量不高，其中?；撬岷枯^高，占比高達(dá)80%，其余如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸含量相對(duì)較高，故需要外加氨基酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)，制備品質(zhì)良好的海鮮風(fēng)味基料。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Single factor experimental results

由圖2可知，以30 mL鮑魚(yú)蒸煮濃縮液為反應(yīng)基液進(jìn)行美拉德反應(yīng)，制備海鮮風(fēng)味基料，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別確定了葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、半胱氨酸的最佳添加量為6.0%、0.4%、2.5%、1.2%、0.12%，反應(yīng)pH為7.5，反應(yīng)時(shí)間為75 min，反應(yīng)溫度為110 ℃。在美拉德反應(yīng)中單糖更易發(fā)生反應(yīng)，其中葡萄糖更為廉價(jià)且反應(yīng)性好，其與氨基酸反應(yīng)比例的不同產(chǎn)生的色澤及風(fēng)味產(chǎn)物也不同，反應(yīng)基料較為稀釋，還原糖量少則反應(yīng)不徹底，量多可能會(huì)發(fā)生焦糖化反應(yīng)而產(chǎn)生糊味，良好的添加量使得產(chǎn)生的風(fēng)味更佳。在所有氨基酸中，賴氨酸參與反應(yīng)能獲得更深色澤且產(chǎn)生新鮮的面包味，而半胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)生的色澤則較淺且會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的肉香味，其余氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生的主要以焦糖味、果香味、花香味等為主，以混合氨基酸、多肽、水溶性蛋白質(zhì)、還原糖等為反應(yīng)基液，通過(guò)外加氨基酸與還原糖獲得良好的反應(yīng)比例，則可得到品質(zhì)較佳、風(fēng)味豐裕柔和的反應(yīng)產(chǎn)物。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件

試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)處理見(jiàn)表6和表7。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental result

由表6可知，F(xiàn)0.05

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

由表6和表7可知，4個(gè)因素中有1個(gè)因素對(duì)風(fēng)味基料的綜合評(píng)分具有顯著的影響(P<0.05)，1個(gè)因素的影響特別顯著(P<0.01)，對(duì)4個(gè)因素的極差R值進(jìn)行分析為RA>RD>RC>RB，其影響程度主次順序?yàn)椋篈(反應(yīng)pH)>D(半胱氨酸添加量)>C(甘氨酸添加量)>B(精氨酸添加量)，以綜合評(píng)分為依據(jù)的較優(yōu)方案為A3B2C1D3即：反應(yīng)pH 8.0、半胱氨酸添加量0.16%、甘氨酸添加量1.5%、精氨酸添加量0.4%。

2.5 風(fēng)味成分分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到的海鮮風(fēng)味基料呈現(xiàn)液狀、金黃色、氣味濃郁、海鮮香味突出、無(wú)較明顯腥味。并對(duì)制備出的海鮮風(fēng)味基料采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖，離子圖譜中對(duì)應(yīng)的化合物及相對(duì)百分含量見(jiàn)表8。

由表8可知，經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)制備的海鮮風(fēng)味基料共檢測(cè)出揮發(fā)性物質(zhì)60種，并由面積歸一法求得各成分的相對(duì)百分含量，并列出匹配度大于75%的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性成分中醇類10種(30.34%)、醛酮類8種(18.49%)、烴類10種(17.07%)、酯類9種(2.49%)、酸類10種(14.77%)、其他類13種(11.57%)，其中醇類、醛酮類、烴類、酸類及其他含氮、氧、硫的化合物含量，均達(dá)到10%以上，特別是醇類，達(dá)到了30%。

醇類化合物對(duì)于香氣的形成具有重要作用，特別是對(duì)海鮮類風(fēng)味基料，在人工調(diào)香及合成香料的過(guò)程中醇類發(fā)揮著重要作用，長(zhǎng)鏈飽和醇雖然閾值較高但也具有清香和芳香味，如3-甲基-1-丁醇具有苦杏仁味，2，3-丁二醇?xì)馕段⑻?，不飽和醇的閾值相?duì)較低，1-辛烯-3-醇、2-苯乙醇、2-呋喃甲醇、2-茨醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、4-甲基-5-噻唑乙醇等具有蘑菇香、泥土香、青草香、肉香等，對(duì)海鮮風(fēng)味的形成具有重要作用，且含量也較高。醛類和酮類化合物都屬于羰基化合物，其對(duì)肉香味成分的形成具有重要作用，其中檢測(cè)到的醛類化合物有：苯甲醛(堅(jiān)果香味)、戊醛(花生味)、癸醛(醛香、酯香)、壬醛(脂肪香)，酮類化合物有：環(huán)戊酮、十三烷酮、1-辛烯-3-酮、2-茨酮，具有甜的花香及果香風(fēng)味，對(duì)海鮮風(fēng)味的形成產(chǎn)生影響。烷烴類化合物廣泛存在于海鮮等魚(yú)類揮發(fā)性成分中，但其閾值較高，對(duì)海鮮風(fēng)味的影響不大[11]。共檢測(cè)出9種芳香類化合物，其閾值較低，可產(chǎn)生明顯香氣，其余如酸類化合物具有刺激性氣味，對(duì)整體風(fēng)味產(chǎn)生影響，呋喃、噻唑、吡嗪類等雜環(huán)類化合物是許多香味的中間體，具有濃郁的肉味、烤香味且閾值較低，不僅對(duì)海鮮風(fēng)味的產(chǎn)生具有重要影響，對(duì)其他產(chǎn)品香氣的形成也具有重要作用。

3 結(jié)論

以在鮑魚(yú)加工中產(chǎn)生的鮑魚(yú)蒸煮濃縮液為反應(yīng)基料，并加入一定比例的葡萄糖、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、半胱氨酸等前體物質(zhì)，在一定條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)可以得到具有一定品質(zhì)的海鮮風(fēng)味基料。

本文首先對(duì)鮑魚(yú)蒸煮濃縮液中的多肽含量進(jìn)行了測(cè)定，又對(duì)其中含有的氨基酸組成成分進(jìn)行了分析，接著通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)影響海鮮風(fēng)味基料品質(zhì)的因素進(jìn)行了研究，重點(diǎn)研究了各前體物質(zhì)的添加量及反應(yīng)條件的不同對(duì)海鮮風(fēng)味基料的影響，其中有較大影響的4個(gè)因素的主次關(guān)系是：反應(yīng)pH>半胱氨酸添加量>甘氨酸添加量>精氨酸添加量，1個(gè)因素具有顯著影響，1個(gè)因素具有特別顯著影響，從而確定正交試驗(yàn)的最優(yōu)反應(yīng)條件為：反應(yīng)pH 8.0、精氨酸添加量0.4%、甘氨酸添加量1.5%、半胱氨酸添加量0.16%，其他試驗(yàn)條件為：葡萄糖6.0%、組氨酸1.2%、反應(yīng)時(shí)間75 min、反應(yīng)溫度110 ℃，得到的海鮮風(fēng)味基料品質(zhì)較高，風(fēng)味突出，最后對(duì)樣品進(jìn)行GC-MS分析檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)60種，其中醇類10種、醛酮類8種、烴類10種、酯類9種、酸類10種、其他類13種。