章海峻 茅利明* 陸春琴

流感病毒（Influenzaviruses，F(xiàn)lu）是引起全球性流行性感冒的病原體，由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有較強的傳染性，無論是世界范圍的大流行還是局限的地區(qū)小流行，均對人類健康產生嚴重的影響［1］。流感的發(fā)病機制主要包括機體免疫系統(tǒng)對病毒的免疫應答和肺損傷機制。越來越多的研究表明，細胞因子水平高低與流感免疫應答強弱、疾病的歸轉及病理損傷有重要的關系［2］。人體抵抗病毒感染主要是以機體細胞免疫為主，而Th1和Th2細胞在介導人體細胞和體液免疫方面發(fā)揮重要作用。Th1和Th2細胞失衡常引起疾病發(fā)生發(fā)展［3］。本文探討流感病毒感染患兒血清中相關細胞因子水平變化特點及流式細胞微球技術檢測相關細胞因子的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2017年10月到2018年4月本院因發(fā)熱、鼻塞、咽痛、流涕頭痛、全身乏力酸痛等流感樣癥狀就診，并經膠體金標記免疫層析技術進行流感病毒抗原檢測為陽性的患兒124例為流感組，男76例，女48例；平均年齡（2.73±0.64）歲。經檢測分型，甲型流感患兒52例，乙型流感患兒72例。另選取同期本院兒科和體檢中心行健康體檢且無流感樣呼吸道癥狀及其它疾病86例健康體檢幼兒為對照組，男56例，女30例；平均年齡（2.85±0.58）歲。診斷標準參照《流行性感冒診療方案》（2018年版）［4］。所有受試對象均同時檢測血常規(guī)及CRP等感染性指標，兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法（1）流感病毒抗原標本采集與檢測：標本采集方法以咽喉拭子采樣為主，用滅菌拭子從口腔內完全插入咽喉中，以咽后壁、上顎、扁桃體等發(fā)紅部位為中心以便采集到黏膜表皮，采集標本24h內送檢。甲型/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒由杭州艾博生物醫(yī)藥有限公司提供，檢測步驟嚴格按照說明書。（2）流感病毒抗原試劑盒性能驗證：①最小檢測靈敏度：本試劑對甲型流感病毒（A2/Aichi/2/68H3N2）的最小檢測靈敏度為1.25×103CEID50/每人分檢測（egginfectiousdose，EID50，雞胚半感染數(shù)量）；對乙型流感病毒（Hongkong5/72）的最小檢測靈敏度為0.5×102CEID50/每人分檢測；②可檢出菌株：甲型流感分別有7個H1N1，5個H3N2，2個H5N1，1個H9N2和1個H7N3亞型，乙型流感有5個亞型，涵蓋所有主要的流感病毒亞型；③交叉反應與干擾物質：流感檢測試劑與不同濃度的病毒、細菌和真菌行交叉反應，其檢測結果均為陰性，慶大霉素、血色素等數(shù)十種不同劑量濃度的OTC藥物均不會對流感檢測產生影響。（3）血常規(guī)標本的采集與檢測：流感組和對照組均按照標準采血操作靜脈采血注入紫色EDTA-K2抗凝管，混勻后2h內上機檢測完畢。檢測指標為白細胞（WBC）、中性粒細胞（Neu）、淋巴細胞（Lym）、嗜酸性粒細胞（Eos）、血小板（PLT）和C反應蛋白（CRP）等。檢測儀器為帶CRP功能的邁瑞B(yǎng)C5390全自動血細胞分析儀，儀器、CRP乳膠免疫比濁法試劑盒（鼠單克隆抗CRP抗體）均由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供，日間室內質控均在正常范圍內。（4）Th1/Th2的樣本處理及檢測：儀器為美國BD公司生產的BDFACSCalibur流式細胞分析儀，試劑盒由杭州賽基生物科技有限公司提供的Th1/Th2細胞因子檢測試劑盒，項目為Th1分泌的IL-2、IFN-r、TNF-α和Th2分泌的IL-4、IL-6、IL-10。樣本處理嚴格按照Th1/Th2細胞因子檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件。符合正態(tài)分布計量資料用（±s）表示，不符合正態(tài)分布的用M（Q1，Q3）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，三組間比較采用Kruskal-Wal-lisH檢驗；計數(shù)資料用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流感組和對照組血常規(guī)、CRP結果比較見表1。

2.2 三組血清細胞因子檢測水平比較見表2。

表2 三組血清細胞因子水平比較［ng/L，M（Q1，Q3）］

3 討論

機體免疫系統(tǒng)對流感病毒感染后所產生的一系列免疫應答及防御措施具有雙重性：一方面以Th1/Th2細胞為主的細胞免疫和體液免疫系統(tǒng)通過啟動分泌各種細胞因子，通過不同細胞因子生物學抗病毒效應，以及級聯(lián)放大效應，從而有效控制流感病毒RNA在上皮細胞胞內的復制以及中和胞外病毒的作用；另一方面，肺部炎癥細胞的浸潤，各種炎性細胞因子的表達及效應產生，造成諸如肺充血、水腫及支氣管肺炎樣改變等并發(fā)癥［5］。人體分泌的各種細胞因子是串聯(lián)起機體宏觀和微觀生理病理變化的橋梁，是免疫應答和免疫調節(jié)等的重要介質。人體內Th1/Th2的平衡是維持機體正常免疫功能的重要因素，Th1/Th2的平衡失調與漂移與疾病的歸轉密切相關。用流式細胞微球技術能快速準確的檢測微觀的細胞因子濃度水平，從而能在細胞因子水平對相應疾病進行發(fā)病機制的探討，能對疾病的臨床診斷、治療、研究和防治起重要作用［6］。

本資料顯示，與健康對照組比較，流感病毒抗原陽性組血常規(guī)中的項目WBC、Eos、Lym、PLT均明顯下降，而CRP則明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這符合病毒感染性疾病的血象規(guī)律，外周血淋巴細胞減少可能是由于淋巴細胞參與病毒滅活引起病毒誘導淋巴細胞凋亡，同時短期內體內病毒超負荷，引起細胞免疫力損傷而降低［7］。此外巨核細胞在病毒感染后破壞增多，以及病毒可能產生循環(huán)分子引起血小板粘附聚集也會引起外周血血小板減少［8］。流感病毒感染引起的細胞或體液免疫是由Th細胞通過分泌不同的細胞因子所誘導的［9］，人體抗病毒感染一般以Th1細胞為主的細胞免疫起主導作用。本資料顯示，與對照組比較，Th1細胞分泌的IL-2和TNF-α均明顯升高（P<0.05）。外周血IL-2表達的上調可以促進細胞毒性T細胞（CTL）分化，同時活化NK細胞，以清除流感病毒。此外，IL-2還可以刺激IFN-γ和TNF-α等細胞因子的分泌［10］。Vohra等研究認為，TNF-α等細胞因子對介導炎癥反應的發(fā)生，調節(jié)免疫應答強度起重要作用，其通過激活T細胞，促進IL-2和IL-6的產生和分泌［11］?？共《炯毎蜃覫FN-γ能直接抑制病毒復制，由MCH-I類分子表達，活化巨噬細胞，直接殺傷靶細胞［12］。Yu等［13］研究認為，患者處于流感早期IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子均有不同程度的上升。而李娟等［6］研究認為，IFN-γ在流行感冒患者發(fā)病初期和正常對照組水平無差異性。本資料結果顯示，IFN-γ在甲型和乙型流感患兒血清中的水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，與李娟等報道結果一致。其機制可能是過高的IL-10水平能造成機體免疫功能的抑制，負反饋抑制IFN-γ的升高，同時使病毒不被免疫系統(tǒng)識別，阻礙病毒清除，導致感染加重［14］。

Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10、IL-13等，促進抗體產生，介導體液免疫應答［15］。本資料顯示，甲/乙型流感感染患兒IL-4在流感組水平明顯低于健康對照組（P<0.05）。IL-4是B細胞的激活分化因子，對體液免疫和抗體產生起重要的作用。IL-4在流感組患者降低主要是由于流感病毒抗原容易變異，人體B細胞不能快速產生保護性抗體，只能通過IL-4等細胞因子促進B細胞的增殖和分化，同時免疫平衡逐漸轉向以細胞免疫為主，從而消耗IL-4［16］。IL-6和IL-10作為體液免疫的主要細胞因子，在流感患兒組水平明顯高于對照組（H為114.26、67.43，P<0.05）。Yu等［13］報道，隨著流感病毒的進展，患者體內IL-6和IL-10的表達水平明顯上升。IL-6是人體重要的促炎性細胞因子，介導組織炎癥反應，調節(jié)免疫應答［17］；IL-10則是抗炎性細胞因子，主要調節(jié)炎癥反應強度，誘導T細胞的分化［18］。本資料中，甲/乙型流感患兒組IL-6和IL-10明顯高于健康對照組，且甲流組要高于乙流組（P<0.05），這可能與不同流感病毒的致病能力有關。IL-10升高可能是機體自身平衡調節(jié)，減輕機體的炎性反應，但過高的IL-10表達，可能會造成機體免疫功能被抑制，妨礙機體流感病毒清除，從而加重病情。LipatovAS等［19］研究認為，由H5N1介導細胞因子失調與其流感病毒的致病能力強弱有關系，高致病的流感病毒更能有效的誘導相應細胞分泌細胞因子。這為流感病毒感染中出現(xiàn)以炎性細胞因子過度表達及功能失調的“細胞因子風暴”提供證據(jù)［20］。因感染導致機體產生大量的細胞因子，進入體液，出現(xiàn)系統(tǒng)性整體反應，如急性呼吸窘迫綜合征甚至多器官衰竭。細胞因子既有助于免疫系統(tǒng)清除感染，也會對機體造成嚴重傷害。因此細胞因子過度表達則越來越多的被認為與較差的臨床轉歸和病理損傷密切相關［21］。