李 祥， 張曉寒， 韓 英， 王 浩， 張澤生,*

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院， 天津 300457；2.鹽城師范學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院， 江蘇 鹽城 224051)

花青素屬于黃酮類(lèi)多酚物質(zhì)，在我們?nèi)粘ｏ嬍持泻艹Ｒ?jiàn)，尤其在紅色、藍(lán)色、黑色和紫色谷類(lèi)、水果和蔬菜中[1]?；ㄇ嗨鼐哂休^強(qiáng)的清除氧自由基和抗氧化能力。近年來(lái)，花青素因其對(duì)人類(lèi)的健康作用引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注[2]。據(jù)報(bào)道，從黑米[3]、藍(lán)莓[4]、紫玉米[5]、黑豆[1]、紫甘薯[6]等食物中提取的花青素在降脂、抗氧化等方面有一定的功效。黑米中的花青素以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷為主要成分[3]。有研究表明花青素的抗氧化能力比維生素C、維生素E和水溶性維生素E (trolox)強(qiáng)3～5倍[7]。Dias等報(bào)道黑米花青素的飲食可以降低某些癌癥、心臟病、糖尿病、阿爾茲海默癥和帕金森等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。果蠅被認(rèn)為是理想的抗衰老研究生物模型，它生命周期短，容易飼養(yǎng)和易繁殖，并且和人類(lèi)有許多共同的抗氧化系統(tǒng)和代謝途徑。因此，本研究選用果蠅作為模型生物，通過(guò)用黑米花青素(black rice anthocyanin, BRA)飼喂果蠅，研究黑米花青素對(duì)其壽命的影響，并進(jìn)一步探究延緩衰老的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米花青素由天津尖峰天然產(chǎn)物研究院提供，花青素成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:cyanidin-3,5-diglucoside (3.12%), cyanidin-3-O-glucoside (83.89%)，petunidin-3-O-glucoside (5.45%)；野生型黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)由筆者實(shí)驗(yàn)室提供；“藍(lán)精靈”(smurf)藍(lán)色染料，美國(guó)Sigma公司；cDNA合成試劑盒、Trizol試劑、SYBRgreen，寶生物工程(大連)有限公司；羅丹明B磺酸鈉鹽(sulforhodamine B sodium salt，SRB)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基的制作方法參考文獻(xiàn)[9]，即1 000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含葡萄糖105 g、玉米粉105 g、酵母21 g、瓊脂13 g。培養(yǎng)基中添加w(4-羥基苯甲酸乙酯)=0.4%，以防止霉菌生長(zhǎng)。對(duì)照組培養(yǎng)基參照基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基分別添加1 mg/mL或5 mg/mL的黑米花青素(分別記為BRA1和BRA5)。

1.2.2果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

選用2 d齡羽化未交配果蠅600只，隨機(jī)分為3組，每組200只。其中對(duì)照組以基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組BRA1和BRA5分別用添加1、5 mg/mL黑米花青素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)，于溫度為(25±1)℃，濕度為65%，交替12 h的光、暗恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d更換新鮮培養(yǎng)基并記錄果蠅死亡狀況，直至全部死亡。

1.2.3果蠅體重的測(cè)定

體重變化被用作測(cè)定食物攝入量的指標(biāo)。在飼養(yǎng)第20天和第50天，用CO2麻醉果蠅，然后稱量并計(jì)算果蠅平均體重。

1.2.4果蠅味覺(jué)的測(cè)定

圖1 果蠅的壽命曲線Fig.1 Lifespan curve of Drosophila melanogaster

通過(guò)進(jìn)行味覺(jué)測(cè)定測(cè)量果蠅的攝入量，方法參照文獻(xiàn)[9]。即在飲食中添加可見(jiàn)染料羅丹明B磺酸鈉鹽，以測(cè)量胃發(fā)紅，以評(píng)估食物攝入量。具體如下，在用蒸餾水浸泡的濾紙上飼養(yǎng)60只果蠅，共3管，禁食24 h。隨后，將果蠅放在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%羅丹明B磺酸鈉鹽的培養(yǎng)基中2 h。最后，采用從0級(jí)(無(wú)色腹部)到5級(jí)(完全紅色腹部)的分級(jí)量表，通過(guò)雙盲法評(píng)分法評(píng)估食物攝入量。

1.2.5果蠅爬行能力測(cè)定

在果蠅飼養(yǎng)第20天和第50天時(shí)，對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行分析，方法參照文獻(xiàn)[10]。即在室溫下，選取每組100只果蠅，將果蠅轉(zhuǎn)移至干凈培養(yǎng)管，輕輕將果蠅抖落至瓶底，記錄30 s內(nèi)果蠅垂直向上爬行距離(測(cè)量分為3組，分別為小于2 cm、2～4 cm、大于4 cm)，測(cè)試3次。

1.2.6果蠅藍(lán)精靈測(cè)定

收集同一時(shí)期果蠅100只，分別培養(yǎng)20 d和50 d后，按照100 mL培養(yǎng)基中添加2 500 mg的藍(lán)色染料1號(hào)，在果蠅飼喂9 h后觀察其腹部顏色。全腹部出現(xiàn)藍(lán)色的果蠅為“藍(lán)精靈”果蠅，記錄各組藍(lán)精靈果蠅的數(shù)量。

1.2.7果蠅抗氧化基因的mRNA表達(dá)水平測(cè)定

第50天時(shí)收集各組果蠅至EP(eppendorf)管內(nèi)，用液氮快速冷凍后放置-80 ℃冰箱備用。利用熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和Rnp11 mRNA的表達(dá)水平。所用的引物設(shè)計(jì)參考實(shí)驗(yàn)室先前發(fā)表文獻(xiàn)[11]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為多次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。采用GraphPad Prism 5.0作圖和數(shù)據(jù)分析，用t檢驗(yàn)和單因素方差分析評(píng)價(jià)差異的顯著性，生存試驗(yàn)采用Log-Rank 檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估壽命的顯著性。P<0.05 為差異性顯著，P<0.01 為差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米花青素對(duì)果蠅壽命的影響

按照1.2.2節(jié)的方法，通過(guò)飼喂果蠅一定劑量的黑米花青素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑米花青素在一定程度上可以延長(zhǎng)果蠅的壽命，如圖1和表1所示，與對(duì)照組比，雄性果蠅BRA5組平均壽命從70 d延長(zhǎng)到82 d，延長(zhǎng)了17%(P<0.05)。雌性果蠅BRA5組與對(duì)照組相比平均壽命從75 d延長(zhǎng)到了83 d，延長(zhǎng)了11%(P<0.05)。黑米花青素對(duì)雄性和雌性果蠅的壽命延長(zhǎng)有劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。本研究中黑米花青素對(duì)壽命影響的結(jié)果與先前報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)果一致，Peng等研究顯示藍(lán)莓花青素可以延長(zhǎng)果蠅壽命10%[4]。因此，我們認(rèn)為黑米花青素和藍(lán)莓花青素對(duì)延緩衰老有相同的作用。BRA5組的延長(zhǎng)壽命效果大于BRA1組，且考慮到衰老會(huì)受荷爾蒙的影響[9]，后期實(shí)驗(yàn)主要用雄性果蠅和5 mg/mL的劑量為研究對(duì)象。

表1 黑米花青素對(duì)果蠅壽命的影響

*P<0.05 為差異性顯著。

2.2 黑米花青素對(duì)果蠅進(jìn)食量和體重的影響

飲食限制被認(rèn)為有延長(zhǎng)壽命的效果[12]，本研究為了排除飲食限制對(duì)壽命的影響，根據(jù)1.2.3節(jié)的方法測(cè)量了果蠅的體重，即果蠅在20 d和50 d時(shí)的體重。根據(jù)1.2.4節(jié)方法測(cè)定了果蠅的飲食攝入量，即在培養(yǎng)基中添加0.2%w(羅丹明B磺酸鈉鹽)，羅丹明B磺酸鈉鹽是一種遇酸顯紅的水溶性熒光染料，當(dāng)攝入羅丹明B磺酸鈉鹽的食物后，在果蠅腹部位置的紅色面積越大說(shuō)明其飲食攝入量越大。結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組和BRA5組的果蠅無(wú)論是在20 d時(shí)還是50 d時(shí)，其體重均無(wú)顯著差異(P>0.05)，飲食攝入量也無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明黑米花青素對(duì)果蠅壽命的影響可以排除飲食限制對(duì)其的作用。

圖2 黑米花青素對(duì)果蠅體質(zhì)量和進(jìn)食量的影響Fig.2 Effect of black rice anthocyanin on body weight and redness index of Drosophila melanogaster

2.3 黑米花青素對(duì)果蠅運(yùn)動(dòng)能力的影響

爬行實(shí)驗(yàn)是評(píng)估果蠅的運(yùn)動(dòng)能力，主要是依據(jù)果蠅自身逆重力爬行的生理特性進(jìn)行的。Wang等研究紫薯提取物對(duì)果蠅壽命的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)正常飲食和高脂飲食組果蠅逆重力爬行能力都顯著降低，當(dāng)喂食10 mg/mL的紫薯提取物時(shí)果蠅爬行能力顯著高于對(duì)照組[9]。如圖3所示，在第20天時(shí)，BRA5組和對(duì)照組的果蠅都很活躍，80%的果蠅都能快速爬到頂部，兩組之間無(wú)差異。當(dāng)喂養(yǎng)到第50天，進(jìn)入衰老期時(shí)，對(duì)照組只有10%的果蠅爬行超過(guò)4 cm，BRA5組有50%的果蠅能夠迅速爬到管頂部。BRA5組僅有27%的果蠅爬行不到2 cm高，同樣的情況下對(duì)照組有80%的果蠅爬行距離小于2 cm。因此，黑米花青素可以緩解衰老引起的運(yùn)動(dòng)能力退化。

圖3 黑米花青素對(duì)果蠅爬行能力的影響Fig.3 Effect of black rice anthocyanin on climbing ability of Drosophila melanogaster

2.4 黑米花青素對(duì)果蠅腸道屏障功能的影響

隨著果蠅衰老，在腸道屏障功能上也會(huì)表現(xiàn)出紊亂，這可以通過(guò)藍(lán)精靈實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)果蠅腸道的完整性。果蠅飼養(yǎng)到第20天和第50天時(shí)，通過(guò)在培養(yǎng)基里添加2.5%的藍(lán)色染料，喂養(yǎng)9 h，當(dāng)染料在消化道外被觀察到時(shí)，這只果蠅被認(rèn)為是“藍(lán)精靈”。如圖4所示，在20 d齡果蠅中，黑米花青素組與對(duì)照組的藍(lán)精靈的比例無(wú)差異。當(dāng)果蠅進(jìn)入衰老期50 d時(shí)，差異極顯著(P<0.01)，對(duì)照組的藍(lán)精靈比例達(dá)到了22%，而喂食黑米花青素組的比例僅有15%，可見(jiàn)，黑米花青素有保護(hù)腸道完整性的作用。

圖4 黑米花青素對(duì)果蠅腸道完整性的影響Fig.4 Effect of black rice anthocyanin on intestinal integrity of Drosophila melanogaster

所有后生動(dòng)物腸道中都存在大量的微生物[13]，果蠅中腸區(qū)域中有5～10種微生物3.5×105個(gè)共生菌[14]。這些微生物失衡會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生，需要激活抗菌天然免疫系統(tǒng)予以清除[15]。腸道干細(xì)胞(intestinal stem cells，ISCs)是果蠅腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)者，它可以通過(guò)不斷地進(jìn)行分裂和分化，調(diào)節(jié)新細(xì)胞的產(chǎn)生與凋亡細(xì)胞的清除之間的動(dòng)態(tài)平衡，使果蠅腸道內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定健康的狀態(tài)[16]。研究表明當(dāng)果蠅腸上皮細(xì)胞遭受氧化壓力、病原微生物的感染時(shí)，腸道干細(xì)胞會(huì)快速增殖來(lái)補(bǔ)充新的腸上皮細(xì)胞。但是在長(zhǎng)期的應(yīng)激狀態(tài)下，腸道干細(xì)胞會(huì)過(guò)度增殖，分化形成腸下皮細(xì)胞，腸下皮細(xì)胞又會(huì)通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制分化成具有營(yíng)養(yǎng)吸收功能的腸上皮細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的過(guò)度積累，會(huì)出現(xiàn)腸道的不完整性，甚至出現(xiàn)腸瘺現(xiàn)象[10]。本實(shí)驗(yàn)中花青素可以有效地抑制因衰老引起的腸道細(xì)胞內(nèi)紊亂，保持腸道的完整性。然而，黑米花青素對(duì)腸道干細(xì)胞增殖的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.5 黑米花青素對(duì)果蠅抗氧化基因mRNA表達(dá)水平的影響

熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，以GAPDH為看家基因，與對(duì)照組相比，黑米花青素可以上調(diào)果蠅體內(nèi)的抗氧化酶mRNA表達(dá)水平，如：Mn-SOD(P<0.05)、Cu/Zn-SOD(P<0.01)、CAT(P<0.05)和Rpn11(P<0.05),如圖5所示。

* P<0.05為差異顯著，** P<0.01 為差異極顯著。圖5 黑米花青素對(duì)果蠅抗氧化基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of black rice anthocyanin on mRNA expression of anti-aging genes of Drosophila melanogaster

目前Harman的自由基理論認(rèn)為，生物體的衰老部分是由于活性氧(ROS)的積累，即羥自由基、超氧陰離子和過(guò)氧化氫，它們是有氧代謝的副產(chǎn)物。生物體有兩種抗氧化系統(tǒng)清除活性氧，第一個(gè)系統(tǒng)是由一組內(nèi)源性抗氧化酶組成，即超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)，另外一個(gè)體系是一組外源性抗氧化劑，如維生素C和維生素E，以最終消除ROS對(duì)生物體的影響。另外，各種生物標(biāo)志物檢查被廣泛用于氧化應(yīng)激、生理老化和年齡相關(guān)的疾病。去泛素化酶Rpn11基因可以抑制神經(jīng)性退行，敲出Rpn11后會(huì)導(dǎo)致泛素蛋白的積累，從而減少壽命[17]。本實(shí)驗(yàn)中黑米花青素顯著上調(diào)了果蠅體內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)水平，延長(zhǎng)了果蠅的平均壽命。Chiang等[18]研究了黑米花青素對(duì)HepG2細(xì)胞和C57BL/6小鼠氧化應(yīng)激能力，發(fā)現(xiàn)黑米花青素組的ROS顯著低于對(duì)照組， SOD和CAT酶活力顯著提高。本研究中黑米花青素顯著上調(diào)了果蠅體內(nèi)抗氧化基因(Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Cat)的表達(dá)水平，延長(zhǎng)了果蠅的平均壽命。果蠅體內(nèi)Rpn11基因在喂食黑米花青素后也表達(dá)水平也顯著提升，Rpn11的高表達(dá)可以緩解衰老引起的26 S蛋白酶體活性降低，抑制衰老相關(guān)的神經(jīng)性退行疾病進(jìn)程。

3 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)中，以果蠅作為模型生物研究了黑米花青素對(duì)其壽命的影響。生存實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的黑米花青素飼喂果蠅后能延長(zhǎng)其平均壽命和健康壽命。

運(yùn)動(dòng)能力的退化是果蠅衰老的一個(gè)指標(biāo)，主要是依據(jù)果蠅自身逆重力爬行的生理特性進(jìn)行測(cè)定。在本試驗(yàn)中，在5 mg/mL黑米花青素培養(yǎng)基中飼喂50 d后，爬行距離大于4 cm的果蠅比例明顯大于對(duì)照組，說(shuō)明黑米花青素能緩解衰老引起的運(yùn)動(dòng)能力退化。

腸道屏障功能也是果蠅衰老的一個(gè)指標(biāo)。果蠅衰老后其腸道干細(xì)胞會(huì)異常增殖, 屏障功能降低, 因此腸道完整性下降, 通透性增加。在本試驗(yàn)中，飼喂5 mg/mL黑米花青素的藍(lán)精靈果蠅比例明顯低于對(duì)照組?？梢?jiàn)，黑米花青素可有效抑制果蠅因衰老引起的腸道通透性，保護(hù)腸道的完整性。

飼喂一定劑量的黑米花青素可以延長(zhǎng)果蠅的平均壽命和健康壽命，緩解因衰老引起的運(yùn)動(dòng)能力降低。此外，黑米花青素可以通過(guò)影響抗氧化基因的表達(dá)水平增加抗氧化能力，保護(hù)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而延緩了果蠅的衰老。