馬曉蕾 趙莉君 魏青英 朱瑤迪 趙改名 李苗云

摘 要：以燒雞和醬牛肉為介質(zhì)，研究不同冷卻速率對醬鹵肉制品中產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）芽孢生長特性的影響。結(jié)果表明：在不同的冷卻速率下，總冷卻時間4 h時，冷卻前后C. perfringens的生長量小于1 （lg（CFU/g））;降低冷卻速率，C. perfringens芽孢會大量萌發(fā)、生長繁殖;總冷卻時間為7、8、10、12、14 h時，燒雞中C. perfringens的增長量分別為1.022、2.397、3.539、4.404、4.917 （lg（CFU/g）），醬牛肉中增長量分別為1.280、2.931、4.195、4.901、5.036 （lg（CFU/g）），均大于1 （lg（CFU/g））。因此對于熟制的醬鹵肉制品應(yīng)控制在4 h內(nèi)快速冷卻，最多不應(yīng)超過7 h，且冷卻前后C. perfringens的相對生長量控制在1 （lg（CFU/g））內(nèi)，以提高肉類產(chǎn)品的食用安全性。

關(guān)鍵詞：醬鹵肉制品;產(chǎn)氣莢膜梭菌;芽孢萌發(fā);冷卻速率;控制

Abstract： In this study， the effects of different cooling rates on the growth characteristics of Clostridium perfringens in roast chicken and sauced beef as representatives of soy sauce and pot-roast meat products were investigated. The results showed that the count of C. perfringens after cooling for 4 h at all rates tested increased by less than 1 （lg （CFU/g））. At lower cooling rate，?C. perfringens spores germinated， grew and multiplied in larger numbers. When the total cooling time was 7， 8， 10， 12， and?14 h， the count of C. perfringens in roast chicken and sauced beef increased by 1.022 and 1.280 （lg （CFU/g））， 2.397 and 2.931 （lg （CFU/g））， 3.539 and 4.195 （lg （CFU/g））， 4.404 and 4.901 （lg （CFU/g））， 4.917 and 5.036 （lg （CFU/g））， respectively. Therefore， the cooling time should be controlled within 4 h and should not exceed 7 h at most， and the increase in the count of C. perfringens during cooling should be controlled within 1 （lg （CFU/g）） to improve the product safety.?Keywords： sauce and pot-roast meat products; Clostridium perfringens; spore germination; cooling rate; control

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200914-223

中圖分類號：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）11-0009-05

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）為革蘭氏陽性厭氧芽胞菌，在環(huán)境脅迫（低溫、干燥或營養(yǎng)缺乏等）下形成芽孢，其芽孢對高溫、高壓、強酸及強堿等環(huán)境均具有極強的抗逆性，很難殺滅[1-2]。在環(huán)境適宜時，C. perfringens芽孢能夠萌發(fā)、生長并產(chǎn)生毒素[3-5]，是引起食源性胃腸炎最常見的病原菌之一[6-7]，會導(dǎo)致腹瀉、腹痛等食源性疾病[8-9]。據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心估計，美國平均每年有約10 萬例胃腸道疾病由C. perfringens引起，并將其列為第三常見食源性疾病致病菌[10]。

肉制品烹飪后不恰當(dāng)?shù)睦鋮s工藝[11-12]和不合適的貯存溫度[13-15]是導(dǎo)致C. perfringens大量生長的主要原因。提高熱處理溫度不但不能殺滅高熱抗性芽孢，反而能激活殘存芽孢[16-17]，在后續(xù)冷卻過程中可使芽孢萌發(fā)、生長并產(chǎn)生毒素[18-20]，對食品安全和公眾健康造成嚴(yán)重威脅。因此，熱處理后的肉制品在冷卻過程促使C. perfringens芽孢萌發(fā)并產(chǎn)生毒素，由此引發(fā)的食品安全問題不容忽視。

為了保障公眾健康，美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗局對西式肉制品的冷卻工藝制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)[21]。如果食品加工者未按標(biāo)準(zhǔn)冷卻產(chǎn)品，則必須提供驗證措施，以證明該產(chǎn)品在冷卻前后的C. perfringens相對生長量不超過1 （lg（CFU/g））[22]，若冷卻不當(dāng)，微生物即會大量繁殖。食用含菌量達5 （lg（CFU/g））以上的受污染食品時可能會引起食物中毒[23-24]。Jaloustre等[25]在動態(tài)加熱條件下，對牛肉醬產(chǎn)品中C. perfringens芽孢的滅活進行研究，并提出考慮潛在變異源的控制措施，在不改變產(chǎn)品味道的基礎(chǔ)上，先提高溫度刺激芽孢，使芽孢萌發(fā)生長，后滅菌處理，殺死營養(yǎng)細胞。我國傳統(tǒng)的醬鹵肉制品香氣濃郁、肥而不膩，但是產(chǎn)品微生物污染嚴(yán)重[26]。王小慧等[27]調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在河南省鄭州市熟雞肉市場中C. perfringens的污染率為17.3%，其中燒雞的污染率為12.7%，且C. perfringens菌落數(shù)達5.2 （lg（CFU/g））。傳統(tǒng)醬鹵肉制品鹵煮后基本處于無菌狀態(tài)，但是后續(xù)的冷卻過程是芽孢萌發(fā)和生長的關(guān)鍵，如何調(diào)控冷卻降溫程序，控制醬鹵肉制品中C. perfringens的生長是目前面臨的重要問題。

因此，本研究以我國傳統(tǒng)醬鹵肉制品的典型代表燒雞和醬牛肉為介質(zhì)，研究不同冷卻降溫程序?qū)u和醬牛肉中C. perfringens芽孢萌發(fā)和生長的影響，為有效控制C. perfringens芽孢生長、規(guī)范醬鹵肉制品的生產(chǎn)加工規(guī)程、保障產(chǎn)品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：C. perfringens由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院從真空脹袋的鹽焗雞中分離并鑒定得到，且經(jīng)過國標(biāo)法鑒定、VITEK鑒定及分子測序鑒定;菌株采用-80 ℃磁珠保存。

燒雞：購于河南省鄭州市某燒雞品牌店，選取當(dāng)日鹵制的新鮮燒雞樣品（從出鍋到采樣時間控制在12 h以內(nèi)）;醬牛肉：當(dāng)日鹵制的新鮮醬牛肉，購于河南省鄭州市某超市;購買后立即運回實驗室，在無菌操作臺中處理。

液體硫乙醇酸鹽（fluid thioglycollate，F(xiàn)TG）培養(yǎng)基、庖肉培養(yǎng)基、產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)（tryptose sulfite cycloserine agar base，TSC）培養(yǎng)基、0.1 g/100 mL無菌蛋白胨水溶液 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;一次性無菌培養(yǎng)皿 江蘇省泰州市利康醫(yī)療器具有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;AW200SG厭氧工作站 英國Electrotek公司;DZ-260PD真空包裝機? ?溫州市大江真空包裝機械有限公司;ALLEGRA-64A高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;Easy Mix均質(zhì)機? ?法國AES公司;MIR-254低溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;HH-501數(shù)顯超級恒溫水浴 金壇市杰瑞爾電器有限公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢懸浮液的制備

無菌條件下，將冷凍保存的菌株在TSC培養(yǎng)基上37 ℃活化2 次。挑取活化后的TSC平板上典型的黑色單一菌落接種到10 mL庖肉培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。按照J(rèn)uneja等[28]的方法制備芽孢：吸取0.1 mL庖肉培養(yǎng)基樣液接種到10 mL新制備的FTG培養(yǎng)基中，75 ℃熱激20 min，并在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)18 h;取該培養(yǎng)液1 mL接種到9 mL FTG培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)4 h;將0.1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到10 mL產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，并進行芽孢染色，顯微鏡觀察芽孢的形態(tài)和數(shù)量。當(dāng)芽孢數(shù)量達到95%時收集芽孢。將所得的芽孢懸浮液在4 ℃、7 000×g條件下離心20 min收集芽孢，并用無菌水洗滌2 次，懸浮保存在0.1 g/100 mL無菌蛋白胨水溶液中（約107 CFU/mL），備用。

1.3.2 樣品處理

取新鮮的燒雞（水分活度（water activity，aw）0.987 3、pH 6.34、水分含量61.04%、鹽含量1.59%）和醬牛肉（aw 0.989 6、pH 6.12、水分含量66.4%、鹽含量1.74%），無菌條件下將雞肉去骨，醬牛肉去牛筋，然后處理成大小均勻、約1 cm見方的肉塊，在絞肉機中攪碎，蒸鍋中蒸汽滅菌15 min，待自然冷卻后分裝。每袋稱取25 g肉樣并進行真空包裝（抽真空時間18 s，相對真空度-0.1 MPa），置于-25 ℃貯藏。使用前在4 ℃解凍。

將芽孢懸浮液稀釋至3～4 （lg（CFU/mL）），吸取2.5 mL接種到25 g肉樣中，手動混勻，并將樣品壓平（約1 mm厚），以確保受熱均勻，采用雙層袋真空包裝，袋中間添加除氧劑。將接種懸浮液的樣品放置在水浴鍋中75 ℃熱激20 min后在冰上迅速冷卻至55 ℃。

1.3.3 冷卻降溫模式

55 ℃是芽孢的萌發(fā)溫度，27 ℃是大多數(shù)食源性病原菌快速增長至緩慢增長的過渡溫度[29]，故冷卻程序分為兩段式，即55～27 ℃和27～4 ℃。利用可編程精密培養(yǎng)箱，在55 ℃維持5 min，然后進入冷卻降溫模式。共設(shè)計6 個降溫模式，分別為降溫模式1～6，總降溫時間分別為4、7、8、10、12、14 h。定期（每隔1 h）取出樣品測定C. perfringens菌落數(shù)，同時記錄培養(yǎng)箱中的溫度變化。

1.3.4 菌落計數(shù)

冷卻降溫模式下，每隔1 h將樣品從培養(yǎng)箱中取出，在冰水中迅速冷卻，無菌條件下打開樣品袋（25 g/袋），添加225 mL 0.1 g/100 mL無菌蛋白胨水，在Easy Mix均質(zhì)機上均質(zhì)120 s。將混合液用0.1 g/100 mL無菌蛋白胨水稀釋，二者體積比1∶10，制備10-2～10-6系列稀釋液，吸取稀釋后的菌液0.1 mL至新制備的TSC培養(yǎng)基上，待凝固后再次均勻覆蓋上TSC培養(yǎng)基，正置于培養(yǎng)箱中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，記錄典型菌落數(shù)。各個冷卻降溫程序在每個時間點測定3 個平行樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件中的單因素方差分析和獨立樣本t檢驗比較數(shù)據(jù)差異性，用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 燒雞冷卻過程中C. perfringens的生長情況

采用兩段式冷卻，燒雞和醬牛肉分別在4、7、8、10、12、14 h內(nèi)從55 ℃降溫至4 ℃，降溫模式如圖1所示。

由表1可知，燒雞冷卻時間較短時，C. perfringens的總體變化趨勢較小。在冷卻初期，C. perfringens芽孢萌發(fā)生長緩慢，生長量變化不大，隨后C. perfringens芽孢快速萌發(fā)并出現(xiàn)一定增長。降溫模式1、2在第1階段（55～27 ℃）冷卻過程中C. perfringens的相對生長量差異不顯著，降溫模式3、4、5、6相對生長量差異顯著，表明第1階段的冷卻時間對C. perfringens芽孢萌發(fā)生長影響顯著。對冷卻前后燒雞中C. perfringens的相對生長量進行比較發(fā)現(xiàn)，不同降溫模式下，C. perfringens相對生長量差異顯著，表明不同冷卻時間對C. perfringens芽孢萌發(fā)生長的影響顯著。

用獨立樣本t檢驗比較冷卻前后燒雞中C. perfringens菌落數(shù)差異。由表2可知，不同降溫模式下，冷卻前C. perfringens的菌落數(shù)之間差異不顯著，同一降溫模式下，冷卻前后菌落數(shù)差異極顯著（P<0.01）。降溫模式1、2在冷卻過程中C. perfringens芽孢萌發(fā)數(shù)量不超過5 （lg（CFU/g）），國際認(rèn)可的食用C. perfringens含菌量達到5 （lg（CFU/g））的食物時可致病[23-24]，因此，結(jié)合企業(yè)實際生產(chǎn)，采用降溫模式1快速冷卻對控制燒雞中C. perfringens生長是有效的。

2.2 醬牛肉冷卻過程中C. perfringens的生長情況

由表3可知，降溫模式1、2在第1階段（55～27 ℃）降溫時間相同（圖1），C. perfringens的相對生長量差異不顯著，其他降溫模式對C. perfringens相對生長量影響顯著，表明第1階段的冷卻時間對C. perfringens芽孢萌發(fā)生長影響顯著。從55 ℃降溫至4 ℃，降溫模式5、6時，C. perfringens的相對生長量差異不顯著，其他降溫模式間差異顯著，表明不同降溫模式對C. perfringens芽孢萌發(fā)生長影響顯著。從55 ℃降溫至4 ℃，采用降溫模式1（總冷卻時間4 h）時，C. perfringens相對生長量為0.601 （lg（CFU/g）），采用降溫模式2時C. perfringens相對生長量為1.208 （lg（CFU/g）），C. perfringens相對生長量差異顯著，表明不同降溫模式對C. perfringens芽孢萌發(fā)生長的影響顯著。

由表4可知，不同降溫模式下，冷卻前C. perfringens的菌落數(shù)間差異不顯著，同一降溫模式下，冷卻前后菌落數(shù)差異極顯著（P<0.01），表明降溫模式對醬牛肉中C. perfringens的生長有顯著影響。降溫模式1、2在冷卻過程中C. perfringens的數(shù)量不超過5 （lg（CFU/g））。結(jié)合企業(yè)實際生產(chǎn)，采用降溫模式1快速冷卻對控制醬牛肉中C. perfringens生長是有效的。

2.3 不同介質(zhì)中C. perfringens冷卻降溫過程中相對生長量的比較

由表5可知，降溫模式1、2下，燒雞和醬牛肉中C. perfringens相對生長量差異顯著（P<0.05），降溫模式3、4、5下，差異極顯著（P<0.01），表明C. perfringens的生長與介質(zhì)有關(guān)。由此得出，降低冷卻速率（除模式6），燒雞和醬牛肉中C. perfringens相對生長量差異變大，這可能與2 種肉制品的自身特性有關(guān)。

3 討 論

6 個降溫模式中，燒雞和醬牛肉的冷卻時間為4 h（降溫模式1）時，冷卻前后C. perfringens的相對生長量小于1 （lg（CFU/g））;降低冷卻速率，C. perfringens快速增長，相對生長量大于1 （lg（CFU/g））;在整個冷卻過程中，降溫模式2下冷卻過程中C. perfringens數(shù)量可能超過致病限值，因此，燒雞和醬牛肉的冷卻時間不應(yīng)超過7 h;冷卻時間4 h（降溫模式1）時，冷卻前后C. perfringens的相對生長量小于1 （lg（CFU/g）），因此采用降溫模式1快速冷卻對控制燒雞和醬牛肉中C. perfringens的生長是安全有效的。

Juneja等[28]將約3 （lg（CFU/g））C. perfringens芽孢接種到豬肉中，在12 h內(nèi)從54.4 ℃指數(shù)降溫到7.2 ℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C. perfringens數(shù)量增加3.43 （lg（CFU/g））。本研究中燒雞和醬牛肉在12 h內(nèi)從55 ℃降溫至4 ℃，C. perfringens相對生長量分別為4.404、4.901 （lg（CFU/g））。Kalinowski等[30]研究冷卻對未腌制和腌制火雞中C. perfringens的生長和存活的影響，結(jié)果表明，未腌制的熟火雞在6 h內(nèi)從48.9 ℃冷卻到12.8 ℃時，菌落數(shù)增加2.44 （lg（CFU/g）），腌制的熟火雞在冷卻時間大于6 h時，C. perfringens呈指數(shù)型增長，經(jīng)24 h循環(huán)冷卻后C. perfringens相對生長量為3.07 （lg（CFU/g））。與本研究結(jié)果相似，燒雞和醬牛肉在冷卻時間大于6 h時，C. perfringens相對生長量大于1 （lg（CFU/g））。因此在4 h內(nèi)快速冷卻對控制熟肉制品中C. perfringens的生長是安全有效的。

4 結(jié) 論

綜合本研究結(jié)果和企業(yè)實際生產(chǎn)情況，對于醬鹵肉制品的冷卻降溫來說，應(yīng)確保熟制后4 h內(nèi)快速冷卻，冷卻時間不應(yīng)超過7 h，且冷卻前后的C. perfringens相對生長量應(yīng)控制在1 （lg（CFU/g））內(nèi)。

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