齊 正，薛 云，李宗良，張小沖，雷秋香，張 提，景立紅，劉登湘

1.邢臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邢臺(tái) 054031；

2.邢臺(tái)市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邢臺(tái) 054031；

3.邢臺(tái)市人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北 邢臺(tái) 054031；

4.邢臺(tái)市人民醫(yī)院美容科，河北 邢臺(tái) 054031；

5.巨鹿縣衛(wèi)生學(xué)校內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 055250

乳腺癌是全球最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤［1］，隨著近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的分子靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中非編碼RNA在乳腺癌研究領(lǐng)域也占據(jù)至關(guān)重要的地位。

miRNA是一類長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，它主要通過(guò)靶向mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）從而抑制靶基因的表達(dá)［2-3］。有研究報(bào)道，miR-6775-3p可通過(guò)靶向MAGE-A家族抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展［4］。本研究旨在探討miR-6775-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDAMB-453、MDA-MB-468和BT-549購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青鏈霉素雙抗混合液購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）Mix購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Hiperfect 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，兔抗人β-actin、CDK4、CDK6、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）17和MMP24多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech生物技術(shù)有限公司。

1.2 RTFQ-PCR法檢測(cè)miR-6775-3p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

采用RTFQ-PCR法檢測(cè)4種乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468和BT-549中miR-6775-3p的表達(dá)水平。細(xì)胞培養(yǎng)至呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用TRIzol Reagent提取細(xì)胞的總RNA。按照Promega反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)冰上制備cDNA模板后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-6775-3p和內(nèi)參基因U6的特異性反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增引物購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。本實(shí)驗(yàn)采用2-△△CT法計(jì)算miR-6775-3p的平均相對(duì)表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞miR-6775-3p mimics轉(zhuǎn)染

對(duì)照組（normal control，NC）和miR-6775-3p mimics質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按1×106個(gè)/孔的密度種植于6孔板中。培養(yǎng)24 h后，按照Hiperfect Reagent推薦的轉(zhuǎn)染方法，于每孔中分別加入10 μL miR-6775-3p mimics或?qū)φ战MNC質(zhì)粒和50 μL無(wú)牛清的空RPMI-1640培養(yǎng)基。另將4 μL Hiperfect Reagent加至50 μL無(wú)牛清的空RPMI-1640培養(yǎng)基中，分別混勻靜置5 min。再將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置20 min后加至每孔使終體積達(dá)到2 mL。轉(zhuǎn)染6～8 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)溫育24～48 h。

1.4 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力

采用CCK-8（美國(guó)MCE公司）檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453的增殖能力。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按照1×103個(gè)/孔的密度種植于96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。分別于第0、1、2、3、4、5 d時(shí)在每孔輕輕加入10 μL CCK-8試劑，避免產(chǎn)生氣泡，振蕩器搖勻5 min后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育1～2 h。采用Magellan for F50酶標(biāo)系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞的450 nm吸光度（D）值。

1.5 Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

采用transwell小室法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453的遷移和侵襲能力。將低溫融化的Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液按照1∶7稀釋，震蕩混勻后于24孔板中加入20 μL，之后放在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜凝固。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453重懸于200 μL無(wú)血清的空RPMI-1640培養(yǎng)基中，按照2×105個(gè)/孔的密度種植于transwell小室上，而24孔板的每孔中加入800 μL帶牛清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。注意24孔板中加Matrigel基質(zhì)膠時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，不加Matrigel基質(zhì)膠時(shí)則檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育48 h后，用4%多聚甲醛固定20 min，然后結(jié)晶紫染色10 min，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)目并拍照。

1.6 采用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用PBS緩沖液清洗2～3次，細(xì)胞刮刀收集至1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min。棄去上清液，在細(xì)胞沉淀中加入RIPA裂解液和適量蛋白酶抑制劑PMSF（1∶100），吹打混勻后冰上裂解1～2 h。12 000 r/mim，4 ℃離心30 min后吸取上清液。加入適量蛋白變性緩沖液后行10% SDS-PAGE，然后經(jīng)低溫電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉60 min。用TBST洗膜3次后加入β-actin、CDK4、CDK6、MMP17和MMP24一抗（1∶1 000），4 ℃搖床溫育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，加入二抗37 ℃溫育1 h，TBST洗3次后滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，采用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)用±s表示，組間的兩兩比較采用Student t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-6775-3p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

本實(shí)驗(yàn)選取4種人乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468和BT-549，采用RTFQ-PCR法檢測(cè)這4種細(xì)胞系中miR-6775-3p的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDAMB-468和BT-549中miR-6775-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.02±0.04）、（0.80±0.04）、（0.65±0.07）和（0.43±0.04）（圖1）。其中，MDA-MB-453細(xì)胞中miR-6775-3p的表達(dá)水平最低，故接下來(lái)選用MDA-MB-453細(xì)胞進(jìn)行miR-6775-3p的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-6775-3p在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDAMB-453、MDA-MB-468和BT-549中的表達(dá)Fig.1 miR-6775-3p expression levels in four human breast cancer cell lines MDA-MB-231,MDA-MB-453,MDA-MB-468 and BT-549

2.2 轉(zhuǎn)染miR-6775-3p mimics對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453中miR-6775-3p表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)利用miR-6775-3p mimics模擬物轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453后，通過(guò)RTFQ-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-6775-3p的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，miR-6775-3p mimics轉(zhuǎn)染組的MDA-MB-453細(xì)胞中miR-6775-3p表達(dá)水平比NC對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1 198.00±27.47 vs1.00±0.05，P＜0.001，圖2）。以上數(shù)據(jù)表明，MDA-MB-453細(xì)胞已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了miR-6775-3p的過(guò)表達(dá)。

圖2 RTFQ-PCR法檢測(cè)miR-6775-3p mimics轉(zhuǎn)染后MDAMB-453細(xì)胞中miR-6775-3p 的表達(dá)變化Fig.2 The expression of miR-6775-3p in MDA-MB-453 cells transfected with miR-6775-3p mimics or normal control (NC)group was detected by RTFQ-PCR

2.3 miR-6775-3p可能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力

本實(shí)驗(yàn)將miR-6775-3p mimics轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453后，采用CCK-8法檢測(cè)miR-6775-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。本研究采用第1、2、3、4天的D450nm與第0天的D450nm的比值為縱坐標(biāo)繪制增殖曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3，在轉(zhuǎn)染第2、3、4天后，miR-6775-3p過(guò)表達(dá)組中乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453的增殖能力與NC對(duì)照組相比明顯降低（第2天/第0天：3.34±0.74 vs 2.15±0.25，P＜0.05；第3天/第0天：5.45±0.97 vs 3.41±0.56，P＜0.01；第4天/第0天：6.78±1.21 vs 3.99±0.81，P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 miR-6775-3p可能抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-6775-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDAMB-453遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-6775-3p mimics組中遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)目均比NC對(duì)照組顯著減少（遷移：105.60 ±8.69 vs 223.40±13.41，P＜0.001；侵襲：22.20±3.31 vs 54.80±5.60，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。以上數(shù)據(jù)表明miR-6775-3p可能抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.5 miR-6775-3p抑制乳腺癌細(xì)胞中CDK4、CDK6、MMP17和MMP24的表達(dá)

為探究miR-6775-3p抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的分子機(jī)制，本研究采用TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得出，miR-6775-3p與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4和CDK6，以及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移標(biāo)志物MMP17和MMP24的3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)（表1）。為驗(yàn)證上述結(jié)合位點(diǎn)的活性，我們接下來(lái)采用RTFQ-PCR法檢測(cè)MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-6775-3p mimics后CDK4、CDK6、MMP17和MMP24的mRNA表達(dá)變化，結(jié)果如圖5A所示，轉(zhuǎn)染miR-6775-3p mimics的MDA-MB-453細(xì)胞中CDK4、CDK6、MMP17和MMP24 mRNA的表達(dá)水平均比對(duì)照組明顯下降（P＜0.01）。采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CDK4、CDK6、MMP17和MMP24蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-6775-3p mimics的MDA-MB-453細(xì)胞中CDK4、CDK6、MMP17和MMP24蛋白的表達(dá)水平均比對(duì)照組明顯下降（P＜0.01，圖5）。

圖3 miR-6775-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453增殖能力的影響Fig.3 The effect of miR-6775-3p on the proliferative capacity of breast cancer cell MDA-MB-453 was measured by CCK-8 assay

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-6775-3p mimics后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453的遷移和侵襲能力Fig.4 The migration and invasion capacity of MDA-MB-453 cells after transfection with miR-6775-3p mimics was detected by transwell migration and invasion assay

表1 miR-6775-3p與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4和CDK6，以及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)MMP17和MMP24的結(jié)合位點(diǎn)Tab.1 The binding sites of miR-6775-3p with the 3’UTR of the cyclin-dependent protein kinases CDK4 and CDK6,as well as the cell invasion and metastasis related markers MMP17 and MMP24

圖5 RTFQ-PCR（A）和Western blot（B）檢測(cè)miR-6775-3p mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-453細(xì)胞后CDK4、CDK6、MMP17和MMP24的mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.5 The expressions of CDK4，CDK6，MMP17 and MMP24 in MDA-MB-453 cells transfected with miR-6775-3p mimic were detected by RTFQ-PCR (A) and Western blot (B)

3 討 論

miRNA是近幾年研究較為廣泛的一類真核生物體內(nèi)普遍存在的非編碼RNA分子，一般在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)水平［5-7］。乳腺癌是女性常見(jiàn)的一種惡性疾病，目前乳腺癌的治療以手術(shù)為主，根據(jù)乳腺癌的不同分期及組織分型聯(lián)合放療、化療、內(nèi)分泌治療和生物靶向治療等綜合治療手段，以達(dá)到最佳的治療效果，提高患者生存率［8-9］。而現(xiàn)在人們對(duì)乳腺癌的腫瘤發(fā)生與進(jìn)展轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，嚴(yán)重影響乳腺癌患者的診斷及治療，故尋找更多更有效的分子靶點(diǎn)，是當(dāng)前解決這一醫(yī)學(xué)難題的重中之重。

本研究結(jié)果表明，miR-6775-3p能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。為了進(jìn)一步探究miR-6775-3p抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的分子機(jī)制，我們采用了TargetScan 7.2在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-6775-3p下游的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-6775-3p與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4和CDK6，以及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移標(biāo)志物MMP17和MMP24的3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。

細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclindependent protein kinase，CDK）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,分為CDK1～CDK13共13個(gè)成員［10］，能夠與細(xì)胞周期蛋白（cyclin）協(xié)同發(fā)揮作用，是尤為重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子［11］。有研究表明，CDK4和CDK6可促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，在惡性腫瘤的增殖方面起關(guān)鍵作用［12］。MMP家族屬于一種鋅依賴性蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而破壞腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)要突破的組織屏障，在癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要功能［13-14］。MMP17是MMP家族的一個(gè)重要成員,能夠激活蛋白聚糖酶血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶4（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，ADAMTS4），進(jìn)一步水解蛋白聚糖而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解［15］。MMP24屬于一種膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（membrane-type matrix metalloproteinase，MT-MMP）家族成員，不僅在正常組織中可檢測(cè)到其表達(dá)，在多種類型的腫瘤中也發(fā)現(xiàn)其不同程度的表達(dá)［16-17］。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-6775-3p能通過(guò)結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4和CDK6，以及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移標(biāo)志物MMP17和MMP24的3’UTR，負(fù)向調(diào)控它們?cè)谌橄侔┘?xì)胞中mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。