重慶醫(yī)科大學細胞生物學與遺傳學教研室，重慶400016

早期的乳腺癌可以通過手術(shù)、化療或放療等改善患者的生活質(zhì)量，但仍有20%～30%的女性患者復發(fā)［1］。目前國際通用的乳腺癌分類標準可將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性型、三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）及其他特殊類型乳腺癌［2］。與線性RNA不同的是，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且屬一類特殊的非編碼RNA，所以具有序列保守性和組織特異性且不易被核酸外切酶降解［3-6］。研究表明，circ RNA參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程［7］。本文探究在乳腺癌組織中hsa_circ_0050900的表達水平以及敲低后對細胞增殖、遷移等生物學行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本及細胞系

本研究中的30對乳腺癌組織及癌旁組織保存于重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院分子醫(yī)學與腫瘤研究中心。所有組織標本均來自于重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，且30例患者（均為女性）手術(shù)前均簽署知情同意書，標本切除后經(jīng)病理科冰凍切片診斷確認后立刻于液氮中保存。標本和臨床信息的收集均得到重慶醫(yī)科大學倫理委員會批準。乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3以及正常人乳腺上皮細胞MCF-10A保存在重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院分子醫(yī)學與腫瘤研究中心。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自重慶比歐賽因生物科技有限公司，DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，MEBM培養(yǎng)基套裝購自瑞士LONZA公司，si-circ（sihsa_circ_0050900）以及siRNA（siRNA-negative control，si-NC）質(zhì)粒設計與合成由廣州吉賽生物科技股份有限公司完成，胰蛋白酶購自重慶鼎國生物技術(shù)有限責任公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自重慶茂百生物科技有限公司，TRIzol、PrimeScript RT Reagent Kit和TB Green購自寶生物工程（大連）有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）引物由重慶茂百生物科技有限公司設計與合成，Cell-LightTMEdU Apollo567體外試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司，TUNEL一步法測凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，transwell小室購自重慶比歐賽因生物科技有限公司，細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自武漢博士德生物工程有限公司，SDS-PAGE配膠試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，抗細胞周期蛋白D2（cyclin D2，CCND2）抗體以及抗CDK4抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA測序

選取4對乳腺癌組織和癌旁組織，其提取總RNA檢測濃度與純度，RNase R消化線性RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，質(zhì)檢合格進行測序?qū)嶒?。根?jù)上?？党缮锟萍加邢薰咎峁┑臏y序結(jié)果，篩選出乳腺癌組織和癌旁組織中表達差異最顯著的circRNA hsa_circ_0050900。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

乳腺癌細胞系MCF-7、SK-BR-3以及人乳腺上皮細胞系MCF-10A分別在含有10%FBS的DMEM、RPMI-1640及MEBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3種細胞系均在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每隔24～48 h更換新培養(yǎng)基。待細胞在低倍鏡下觀察密度達到60%～70%時，改用無血清培養(yǎng)基饑餓細胞2 h，使用LipofectamineTM2000分別將si-circ和si-NC轉(zhuǎn)染至MCF-7和SK-BR-3細胞中，待24～36 h后收獲細胞。

1.2.3 RTFQ-PCR檢測

轉(zhuǎn)染24～36 h后，采用TRIzol法提取乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3、正常人上皮乳腺細胞系MCF-10A的總RNA，DEPC水溶解RNA沉淀，并混勻，酶標儀檢測提取RNA濃度與純度。將提取的總RNA按照20 μL體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的條件下進行。使用美國Bio-Rad公司的RTFQ-PCR儀檢測乳腺癌細胞和乳腺癌及其癌旁組織中circRNA hsa_circ_0050900的表達水平。該檢測所用的GAPDH上游引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGA TTTC-3’；hsa_circ_0050900上游引物序列為5’-AAGGACGACCCTGTCACCAA-3’，下游序列引物為5’-CCGTGAAGGTCCTCTGC AT-3’。反應條件為94 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，以cDNA作為模板，GAPDH作為內(nèi)參，雙蒸水補齊至30 μL體系，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔，運用2-△△Ct法計算hsa_circ_0050900在組織和細胞中的表達量。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染36 h后，運用美國Bio-Rad公司細胞計數(shù)儀和細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，將各組細胞配制成密度為2×103個/mL的細胞懸液，將細胞鋪到5塊96孔板中，每組3個復孔。在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天同一時間在孔板中滴加CCK-8溶液，37 ℃溫育2 h，用酶標儀檢測波長為450 nm的吸光度（D）值，連續(xù)檢測5 d。將D值繪制成曲線。

1.2.5 EdU實驗檢測細胞增殖

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染36 h后，將細胞從6孔板接種到帶有爬片的24孔板上，在4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100溶液通透10 min的條件下，根據(jù)Cell-LightTMEdU Apollo567體外試劑盒說明書對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下隨機挑選3個視野進行取像和計數(shù)。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移

細胞轉(zhuǎn)染36 h后，使用200 μL吸嘴在6孔板內(nèi)進行劃痕，更換無血清培養(yǎng)基，置于倒置顯微鏡下拍攝0 h劃痕距離，隨后將6孔板放置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再置于顯微鏡下拍攝24 h劃痕距離，通過計算出的遷移率表示細胞的相對遷移能力。

1.2.7 TUNEL一步法實驗檢測細胞凋亡

細胞轉(zhuǎn)染24 h后，將細胞均勻鋪于帶有爬片的24孔板中，細胞貼壁后，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.5%TritonX-100溶液通透10 min，每孔加入100 μL TUNEL檢測溶液，37 ℃溫育1 h，滴加抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下隨機選取3個視野拍照。

1.2.8 Hoechst 33342染色實驗檢測細胞凋亡

細胞轉(zhuǎn)染36 h后，將細胞接種于帶有爬片的24孔板，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS清洗3次，每次5 min，0.5%TritonX-100溶液通透10 min，PBS清洗3次，每次5 min，經(jīng)Hoechst 33342染液染色30 min，滴加抗淬滅劑，封片，熒光顯微鏡下隨機選取3個視野拍照。

1.2.9 Transwell小室實驗檢測細胞遷移

將200 μL無血清的細胞懸液接種于transwell小室的上室面，下室加入500 μL含有10%FBS的DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基，隨后將帶有小室的24孔板水平放置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，棄掉甲醛，PBS清洗2遍，結(jié)晶紫染色15 min，干燥后鏡下隨機取視野拍照計數(shù)。

1.2.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

用細胞刮收集轉(zhuǎn)染36 h后的各組乳腺癌細胞，加入RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，冰上裂解30 min，每隔5 min渦旋1次。采用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，100 ℃金屬浴10 min。每孔按30 μg蛋白進行上樣，通過恒壓80 v電泳分離30 min，120 v電泳分離60 min，冰浴恒流200 mA轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用蛋白封閉液在搖床上封閉2 h，4 ℃溫育一抗（兔抗GAPDH抗體1∶5 000，兔抗CCND2抗體1∶1 000，兔抗CDK4抗體1∶1 000）過夜，37 ℃溫育二抗（羊抗兔抗體1∶5 000）2 h，化學發(fā)光顯色，用美國Bio-Rad公司凝膠成像儀拍照，并用Image Lab分析成像條帶。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0050900在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中的表達

根據(jù)高通量測序?qū)?對乳腺癌組織和癌旁組織的測序結(jié)果，挑選出在乳腺癌組織中上調(diào)倍數(shù)最高的circRNA hsa_circ_0050900，與癌旁組織相比，其在乳腺癌中表達高出10.07倍（圖1A）。采用RTFQ-PCR檢測hsa_circ_0050900在30對乳腺癌組織和癌旁組織，乳腺癌細胞系MCF-7、SK-BR-3，以及正常人乳腺上皮細胞MCF-10A中的表達水平。結(jié)果顯示，無論在乳腺癌組織還是細胞中，hsa_circ_0050900均顯著高表達（P＜0.001，圖1B～C），此結(jié)果與測序結(jié)果一致。因此選擇hsa_circ_0050900進行接下來的功能實驗驗證。

2.2 hsa_circ_0050900干擾質(zhì)粒的效率驗證

將干擾空載質(zhì)粒si-NC（5’-TTCTCCGAAC GTGTCACGT-3’）和干擾質(zhì)粒si-circ（5’-CA GAGGACCTTCACGGCAT-3’）分別轉(zhuǎn)染MCF-7和SK-BR-3細胞，饑餓培養(yǎng)5 h，換完全培養(yǎng)基再培育24 h，采用RTFQ-PCR技術(shù)檢測兩株細胞中hsa_circ_0050900的相對表達量。通過RTFQ-PCR結(jié)果，相較于轉(zhuǎn)染si-NC的細胞，hsa_circ_0050900的表達水平在si-circ組顯著低表達（圖2），表明干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 RNA-seq分析顯示乳腺癌組織和癌旁組織中部分差異表達的circRNA熱圖以及hsa_circ_0050900在乳腺癌組織和細胞中的驗證Fig.1 Heat map of differentially expressed circRNAs in breast cancer tissues and para-cancerous tissues

圖2 采用RTFQ-PCR對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率進行驗證Fig.2 The transfection efficiency of breast cancer cells was determined by RTFQ-PCR

2.3 敲低hsa_circ_0050900對乳腺癌細胞增殖的影響

將si-NC和si-circ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7和SKBR-3細胞，分別通過CCK-8和EdU實驗，檢測hsa_circ_0050900對細胞增殖能力的影響。CCK-8實驗結(jié)果顯示，MCF-7細胞和SK-BR-3細胞的si-circ組細胞增殖能力都顯著低于對照組si-NC（圖3A）。通過EdU實驗檢測結(jié)果，實驗組si-circ的MCF-7和SK-BR-3細胞，其增殖能力顯著低于si-NC組（圖3B～C）。

2.4 敲低hsa_circ_0050900對乳腺癌細胞遷移的影響

將si-NC和si-circ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進MCF-7和SKBR-3細胞，通過細胞劃痕實驗和transwell小室遷移實驗檢測細胞遷移能力。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-circ的兩株細胞遷移距離顯著小于轉(zhuǎn)染si-NC的遷移距離（圖4A～B）。Transwell小室遷移實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-circ細胞的遷移能力顯著低于si-NC組（圖4C～D）。

2.5 敲低hsa_circ_0050900調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

將si-NC和si-circ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進MCF-7和SKBR-3細胞，采用Western blot檢測CCND2、CKD4蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，相較于si-NC組，CCND2、CKD4蛋白的表達水平顯著降低（圖5A、B）。

2.6 敲低hsa_circ_0050900對乳腺癌細胞凋亡的影響

將si-NC和si-circ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進MCF-7和SK-BR-3細胞，分別通過TUNEL一步法和Hoechst 33342染色實驗檢測細胞凋亡。Hoechst 33342染色實驗結(jié)果顯示，相較于si-NC組，si-circ組表現(xiàn)出以細胞核碎裂為特征的細胞凋亡更明顯（圖6A）。TUNEL實驗結(jié)果顯示，si-circ組凋亡率顯著高于si-NC組（圖6B）。

圖4 下調(diào)hsa_circ_0050900對乳腺癌細胞遷移能力的影響Fig.4 Effects of downregulation of hsa_circ_0050900 on the migration of breast cancer cells

圖5 下調(diào)hsa_circ_0050900對乳腺癌細胞蛋白表達的影響Fig.5 Effects of downregulation of hsa_circ_0050900 on protein levels of breast cancer cells

圖6 下調(diào)hsa_circ_0050900對乳腺癌細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of downregulation of hsa_circ_0050900 on apoptosis of breast cancer cells

3 討 論

近年來，雖然乳腺癌臨床診療水平不斷提高，但其發(fā)病率仍居高不下［8-10］。

circRNA主要位于細胞質(zhì)中，也有部分位于細胞核，表達與結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。研究結(jié)果表明，circRNA參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，進一步的功能探究表明，circRNA通過吸附microRNA作為海綿、誘導血管生成、與RNA結(jié)合蛋白相互作用、促進腫瘤免疫逃逸以及促進形成炎癥微環(huán)境等多種方式參與惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。

本研究使用RNA高通量測序技術(shù)，對4對乳腺癌及其癌旁組織進行分析，通過差異表達譜以及RTFQ-PCR技術(shù)證實circRNA hsa_circ_0050900相較于癌旁組織，在乳腺癌組織中高度表達，并通過RTFQ-PCR技術(shù)進一步證實hsa_circ_0050900在MCF-10A細胞中的表達顯著低于MCF-7以及SK-BR-3細胞。之后我們構(gòu)建針對hsa_circ_0050900的干擾質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染進細胞，進一步進行體外功能實驗驗證。一系列實驗結(jié)果表明，下調(diào)hsa_circ_0050900之后，細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學行為受到抑制。通過TUNEL一步法實驗結(jié)果顯示，下調(diào)hsa_circ_0050900，凋亡細胞數(shù)明顯增多；Hoechst 33342染色實驗顯示核碎裂細胞增多，提示凋亡細胞增加。最后，通過Western blot實驗檢測下調(diào)hsa_circ_0050900之后，CCND2以及CKD4水平降低。CCND2可以與CDK4形成復合物，共同調(diào)控細胞周期。

hsa_circ_0050900的異常表達對細胞增殖、遷移及細胞凋亡均有影響，這些結(jié)果表明hsa_circ_0050900在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。